梓醇对中脑多巴胺能神经元的保护作用

田媛媛

（大连金普新区食品药品检测中心 辽宁 大连 116100）

【摘要】为探讨梓醇对中脑多巴胺能神经元的保护作用，本文采用原代中脑神经元培养，通过乳酸脱氢酶、线粒体复合物I活性及线粒体膜电位等多个指标的检测，观察梓醇对MPP⁺诱导的多巴胺神经元的影响。结果显示梓醇可以减弱MPP+造成的中脑神经元生存力的丧失，降低质膜的破坏，从而减少了细胞中LDH的漏出，并且梓醇也抑制了线粒体膜电位的降低，并呈现出剂量依赖性。本研究表明，梓醇对中脑多巴胺能神经元的损伤有保护作用。

【关键词】梓醇，多巴胺，线粒体

帕金森病 (PD) 是一种以腹侧中脑多巴胺 (DA) 能神经元的退行变性为主要特征的老年性疾病。PD的发病机制尚未明确，与遗传、环境因素、感染、衰老、氧化应激、过多的自由基形成及神经生长因子缺乏等有关,是多种机制协同作用的结果。本研究旨在观察梓醇对原代多巴胺能神经元损伤后的影响并探讨其可能存在的作用机制。

1、实验材料与方法

实验材料

1-甲基-4-苯基吡啶(MPP⁺)来自Sigma。罗丹明123：Sigma。牛血清白蛋白：BM公司。

梓醇：中国药品生物制品检定所。KM孕14天小鼠：大连医科大学动物中心。

实验方法

1.2.1小鼠中脑纯神经元培养

无菌操作下取出胎龄14天的KM小鼠胚胎，分离出腹侧中脑，然后在DMEM/F12中轻柔的机械吹打以破碎组织。1800r离心机械分离后的细胞悬液10min，除去组织细胞碎片。弃上清液，计数重悬后的细胞并接种到多聚赖氨酸(20 µg/ml)预包被的24孔培养板中，细胞接种密度为5×10⁵/孔。本研究选用DMEM/F12外加10%灭活胎牛血清、100U/ml青霉素，100U/ml链霉素作为细胞培养液。细胞培养48小时后，加入10µM Mβ-阿拉伯糖呋喃糖苷(β-D-arabinofuranoside)以抑制胶质细胞增殖。再过48小时，用新鲜的细胞培养液置换出旧的培养液。最初接种的第7天，细胞用于实验。

1.2.2梓醇对MPP+诱导的中脑神经细胞损伤的作用

中脑神经细胞接种到24孔培养板培养到第七天，分别加入0.05-0.5mM不同浓度的梓醇预处理30分钟，然后加入MPP⁺共同培养48小时，培养结束后按MTT法检测细胞活力。

1.2.3 线粒体的分离

处理后的细胞用PBS洗三遍，用10 ml的缓冲液(其中含250mM 蔗糖，0.1mM EGTA 和2mM HEPES, pH 7.4) 把细胞从培养瓶中吹起，含有细胞的液体在4℃ 500g/min, 离心5分钟，收集上清液，4℃，12,000g/min, 离心10min,倾去上清液，将沉淀轻轻地悬浮于蔗糖缓冲液中(其中含130mM 蔗糖，50mM 氯化钾，5mM 氯化镁，5mM磷酸氢钾，5mM HEPES, pH 7.4),将蛋白浓度调整至2 µg/µl,待测定线粒体复合物的活性。蛋白质的含量采用Bradford (1976)的方法测定，用牛血清白蛋白做标准曲线。

1.2.4线粒体复合物I活性的检测

我们通过监测在340nm波长下还原型烟酰胺二核苷酸NADH由于氧化而造成的吸光度降低来检测线粒体复合物I的活性。测定缓冲液含有250 mM 蔗糖，1mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 7.2, 2mM KCN, 2µg/ml 抗酶素A (antimycin A)，0.1 mM NADH 和 0.15mM辅酶Q1 (coenzyme Q1)。在石英比色杯中加入990µl测定缓冲液，在恒温分光光度计中30℃预热2分钟后，加入10µl线粒体蛋白立即混合，总的测量体积为1 ml。启动反应, 5秒后记录340nm处吸光度的降低速率。再在另外一个石英杯中加入989µl 的测定缓冲液，1µl的10µg/ml 的鱼藤酮，重复上述实验，同样记录340nm 处吸光度的降低速率。根据加入鱼藤酮前后340nm 处吸光度的降低速率的差值计算复合物I的活性。

1.2.5 线粒体膜电位的检测

线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential, MMP)采用荧光染料罗丹明123进行检测。罗丹明123是一种可渗透入细胞的阳性荧光燃料，基于线粒体膜电位的负极化而进入到线粒体中。当线粒体膜电位由于细胞的损伤发生去极化时，就会导致线粒体内罗丹明123的减少，既而造成细胞内荧光强度的降低。经过梓醇和MPP⁺处理后的中脑神经元培养体系中加入终浓度为10 µM 的罗丹明123，在37℃下培养30分钟，然后细胞用PBS冲洗三遍，在荧光分光光度计480nm 激发波长和530 nm 发射波长下检测荧光强度的变化。

1.2.6统计学分析

各组实验分别重复三次，数据表示为均值±标准差。采用Student’s-t 检验进行统计分析，p小于0.05认为有统计学意义。

2、实验结果

2.1梓醇对MPP⁺造成的中脑神经元活力降低的影响

中脑神经细胞培养至第七天时加入10µM MPP⁺培养48小时后，细胞的存活率下降至对照组的48.9±3.23%，用梓醇预处理30分钟明显提高了细胞的存活能力并且显示了剂量依赖的关系，在0.5mM 的浓度下，细胞的存活率提高到了82.2±2.87%。

2.2梓醇对MPP⁺介导的中脑神经元线粒体功能的影响

线粒体在细胞凋亡过程中起着重要的作用，线粒体膜电位(MMP)下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一，一旦MMP崩溃，则细胞凋亡不可逆转。因此，我们考察了梓醇对MPP⁺介导的MPP⁺的变化的影响。当用MPP⁺处理细胞48小时后，MMP下降到正常对照组的61.1±3.97%，而梓醇抑制了MMP的降低，当梓醇浓度为0.5mM时，MMP为正常对照的82.3±7.45%。

3、讨论

线粒体功能障碍和脑内氧化应激反应被认为在帕金森病中脑黑质纹状体部位的多巴胺能神经元变性坏死中其着重要的作用。MPTP通过单胺氧化酶B (Monoamine oxidase B, MAO-B)氧化成1-甲基-4-苯基吡啶(MPP⁺),MPP⁺通过多巴胺转运体进入到多巴胺能神经元，通过抑制线粒体复合物I的活性,使ATP合成障碍，多巴胺能神经元因此而凋亡，最终导致帕金森病的发生。

本实验结果显示，梓醇抑制MPP⁺诱导的线粒体功能的紊乱。这个结果说明了梓醇可以抑制线粒体功能的降低从而抑制了细胞内脂质过氧化产物的生成。

【参考文献】

[1]唐希灿。石杉碱甲（双益平）：一种有望治疗早老性痴呆症的药物。中国药理学报，1996（17）：481-484。

[2] 抗氧化剂对帕金森病的保护作用及机制的进展. 张冬齐,徐江平.医学综述2006,1(2):113-115.

[3]Blum D, Torch S, Lambeng N. et al. Molecular pathways involved in the neurotoxicity of 6-OHDA, dopamine and MPTP: contribution to the apoptotic theory in Parkinson’s disease. Progress in Neurobiology 2001, 65, 135– 172.