重链抗体及其基因工程单域抗体的研究和应用进展

蔡家麟1王颖2潘欣1(通讯作者)

（1上海第二军医大学200433；2上海交通大学基础医学院200025）

【摘要】近年来在骆驼和护士鲨等动物的体内发现了一种重链抗体。重链抗体和普通的抗体相比缺少轻链，仅有可变区，但依然保留了抗原结合能力。通过基因工程改造重链抗体形成的单域抗体不仅保留了分子量小、物理稳定性高、容易表达等特性优点，而且亲和力高、不易聚集，被广泛应用于科研和临床诊断。

【关键词】重链抗体单域抗体骆驼科动物

【中图分类号】R392【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）13-0109-02

Thenewresearchandapplicationprogressinheavychainantibodyanditsgeneticengineeringsingledomainantibody

CaiJialin1WangYing2PanXin1*

1.SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China;2.ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025

【Abstract】Inrecentyears,researchersfoundunusualantibodiescomposedonlyofheavychainsfromcamelidsandsharks.Thesepeculiarheavychainantibodies(hcAbs)lacklightchainsbutstillremaindedicatedvariabledomainwiththeantigen-bindingsite.Recombinantsingle-domainantibodyisthesmallestintactantigen-bindingfragmentderivedfromheavy-chainantibodies.TheadvantageousfeaturesofsingledomainantibodyreagentsderivedfromthesehcAbsincludetheirsmalldimension,highapparentstability,highexpression.Asexpectations,high-affinity,improvedsolubilitywithoutanysignofaggregationsingle-domainantibodiescanbewidelyusedinbasicresearchandimproveddiagnosticfield.

【Keywords】heavy-chainantibodysingle-domainantibodycamelid

自1890年抗体被人们发现后，抗体技术已经历了一个多世纪的研究和发展，尤其是1975年诺贝尔奖获得者Kohler和Milstein杂交瘤技术的发明，使多抗和单抗越来越多地应用于临床治疗药物、临床诊断试剂和基础研究领域。单抗类药物的研发成本较高，一般在13亿左右，而传统小分子药物平均约9亿。但是单抗类药物临床试验成功率高、副作用小，平均通过率达30%左右，大大高于传统药物，同时效果也更好，因此受到各大国际药企的追捧，纷纷投入巨额研发资金。从1986年第一个单抗类药物通过FDA的审查到2012年为止已有36个单抗类药物上市，此外还有25个单抗和5个融合抗体进入了临床3期的试验。具估计2011年单抗类药物的市值达到480亿美元，领跑所有的生物类药物，到2012年估计将达到500亿以上[1]。

传统的单抗药物虽然有着上文提到的种种优势但是也存在着各种各样的缺陷和不足。首先，鼠源单抗在临床应用中会致患者体内产生人抗鼠抗体(humananti-mouseantibody，HA-MA)，从而造成各种风险，需要进行必要的人源化（humanlize）[2]。其次，传统抗体分子量大，对肿瘤组织和血管屏障的穿透性差，尤难进入人类高发的实体瘤。此外，由于传统抗体分子较大，在哺乳动物细胞中表达量低，在原核细胞体系中容易出现聚集和无法糖基化等问题，从而使得成本较高，限制了其进一步的应用。

为了解决这些问题，人们利用基因工程技术对多抗和单抗进行改造。先后出现了鼠嵌合抗体、抗原结合片段（antigenbindingfragment，Fab）、单链抗体（single-chainvariablefragment，scFv）和微抗体（minibody）等不同形式的经过基因改造的工程抗体。总体而言其发展方向是小型化，分子量越来越低。小型化不仅有利于在不同表达系统中大量稳定表达，同时也能获得更好的渗透性，到达预设的给药位置。1993年，人们发现骆驼体内存在不含轻链的抗体，这一特殊抗体后来被定名为重链抗体（heavy-chainantibodies，hcAbs），因为其结构特殊，很快被广泛应用到了基因工程抗体研发中。

一、重链抗体和其单域抗体

普通抗体一般由重链和轻链四条多肽链组成，重链分子量较大，轻链分子量较小，两两一组构成抗体的Y字形结构。随着人类对抗体研究的不断深入，人们发现存在单链抗体这一抗体的特殊形式。早在1987年，就在人体内发现确实存在轻链抗体，这是由于人体本身基因缺陷产生的，这些单链抗体不存在抗原结合能力。1993年在美洲驼的血液内发现了缺失轻链但保持抗原结合能力的重链抗体。随后，又相继在美洲驼所属的骆驼科其他动物如羊驼中发现此类的抗体，在银鳐、护士鲨等软骨鱼体内发现了类似的不存在轻链的抗原受体（newantigenreceptor，NAR）。

单域抗体是指只包含抗体正常抗体重链或轻链可变区的基因工程抗体，其分子量远远小于现有的各种抗体，如Ig抗体（150kD），Fab抗体（75kD），scFv抗体（35kD）。上世纪80年代有人尝试用小鼠的VL可变区来抑制溶菌酶的活性并获得成功。随后人们进行了大量研究，由于变化过于剧烈，产生了如亲和力大幅下降，可溶性差等严重问题。重链抗体发现后，由于其天然状态下呈单链形式存在，克服了人源与鼠源抗体亲和力低、易聚集等问题，成为单域抗体研究中的热点。

二、重链抗体和其单域抗体的基因和结构特征

骆驼体内存在分子量各不相同的3种抗体：传统抗体IgG1和重链抗体IgG2/IgG3，其含量在血液中各占了一半，和人类的重链抗体缺失不同的是，骆驼体内的重链抗体在体液免疫中起着重要的作用。

重链抗体中由重链可变区结合抗原的单一结构域构成的抗体称为单域重链抗体（variabledomainoftheheavy-chainofheavy-chainantibody，VHH）[3]。单峰驼的胚系基因中存在CH1区的编码序列，但在mRNA中不存在，因此推测在剪切的过程中重链的第一恒定区（firstconstantdomain，CH1）丢失。由于CH1区和内质网的BIP结合，与抗体从内质网的分泌调节有关，重链抗体因CH1缺失不需与BIP结合，所以在体内的分泌速度也更快。由于CH1区的缺失，重链抗体的可变区和恒定区直接由铰链区连接。由于在基因上与普通抗体相同，所以重链抗体的来源一直是讨论的焦点。2002年，学者们通过比较大量单峰驼和美洲驼VHH的胚系基因，建立了相应的进化树，证明了重链抗体来源于传统抗体的改变而非休眠基因的复苏。随着研究的进一步深入，人们又发现，VH和VHH的胚系基因有部分是共用的，这部分基因的表达产物存在较强的抗原结合能力，通过建立免疫噬菌体库，得到了有较高亲和力的抗体。

普通抗体重链可变区的框架区（frameworkregion，FR）FR2中V42、G49、L50和W52这四个氨基酸残基和轻链相互作用起到稳定双链结构的作用，而在重链抗体的胚系基因序列中突变为亲水性的Phe/Tyr42、Gly49、Arg/Cys50和Leu/Gly52，在Kabatnumbering中这几个残基是45、47、37和44[4]。这四个氨基酸残基的改变，使得重链抗体在缺少轻链的情况下依旧可以保持稳定，并且亲水性得到了一定程度的提高。

通过对大量不同的单峰驼与美洲驼个体的VHH胚系基因序列测序，发现VHH的胚系基因表现出丰富的多样性，从而使得重链抗体能够形成足够与不同抗原结合的大量凸环。通过比较人类重链可变区（variabledomainoftheheavy-chain，VH）VH3基因序列与骆驼的VHH胚系基因序列，发现二者有高度的同源性。因此有人对人源抗体VH结构域FR2的42、49、50和52位点氨基酸残基根据重链抗体中相对应的氨基酸残基进行骆驼化（camilising）改造，所得到的骆驼化人单域抗体不仅保持原有抗体的特异性和亲和力，且溶解性好，稳定性也比原来有了显著提高；同样也有人反其道而行，将重链抗体进行了人源化，获得的抗体也保留了本身的抗原结合能力。

通过晶体衍射结构分析发现，重链抗体可变区与人和小鼠的空间结构相同，都是由β片层结构组成。但存在两点不同，首先，重链抗体的互补决定区（complementarity-determiningregion，CDR）CDR3的长度达到16～18个氨基酸残基，而人CDR3一般为12个氨基酸残基，虽然在美洲驼中存在6个氨基酸残基的CDR3区，但是总体长度和变化要超过人CDR3。其次，在重链抗体的CDR1区和FR2区存在CYS，可以和CDR3形成二硫桥，增加了可变区的稳定性和变化程度。

三、重链抗体改造单域抗体的优势

重链抗体天然缺失轻链，由重链抗体改造而来的单域抗体（single-domainantibody）在自然状态下以单链存在，和人源或鼠源的单域抗体相比其亲和力保存的较好，而人源或鼠源的轻链可变区（light-chainvariabledomain,VL）或VH单域抗体都存在亲和力大幅下降的可能。单域抗体分子量远远小于传统抗体，同时由于缺失FC段等恒定区，因此更容易在各种系统中进行表达。在E.coil表达系统中，其表达量可以在培养基中达到1～10mg/L，并且也可以在酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞中表达。

分子量的减小不仅使得单域抗体表达容易，同样使得其组织渗透性好于普通抗体，可以穿过普通抗体无法通过的物理屏障，并且可以结合一些普通抗体无法结合的隐蔽表位和特殊表位。2002年Muruganandam在研究中发现单域抗体可以在动物模型的脑内发现，因此推测单域抗体具有穿透血脑屏障的能力[3]。

由于单域抗体FR2区中特殊的亲水性氨基酸残基的改变和CDR3区二硫键的存在，其稳定性和亲水性也远远优于传统的VH抗体。有实验显示，一些VHH抗体在90℃的高温下依旧可以和目标抗原结合。单域抗体在溶液中的可溶性很高，不容易产生聚集，可以在极端环境下保持稳定[3]。

四、单域抗体的筛选和应用

VHH来源的单域抗体结构简单，不像scFv等抗体存在正确折叠等要求。单域抗体易于通过基因工程建立免疫/非免疫/半合成抗体库，利用噬菌体/酵母/核糖体等展示技术快速进行筛选，得到目的抗体。使用不同的筛选条件和技术可以得到适应不同需求的各种单域抗体，有人使用洗发水作为固相富集环境，筛选到了可以在洗发水中稳定存在并特异性结合头皮真菌的抗体；有人使用唾液和胃酸作为固相富集环境，筛选出的单域抗体表达在乳酸菌表面，用作口服制剂。此外，有的实验室还依据单域抗体表达稳定、分子量小的特点，结合酵母双杂交技术开发出了在酵母细胞内进行胞内抗体筛选的技术[5]。

单域抗体拥有传统抗体所不具有的稳定性，穿透性和结合能力，可以应用于许多传统抗体难以发挥效应的特殊领域。有实验室筛选到了对蝎子毒素Aahl高亲和力的单域抗体，证明单域抗体具有不同于常规抗体的结构，较易结合隐藏的表位。单域抗体除了可以有效中和动物和昆虫毒素外，还可以中和并清除多种细菌毒素，如肉毒素B和葡萄球菌肠毒素B等，肉毒素B和葡萄球菌肠毒素B都是使用非免疫抗体库获得的。

单域抗体组织渗透性明显高于传统抗体，如针对表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）的特异性抗体可以有效中和EGF竞争结合位点，起到抑制实体瘤生长的作用，并在动物体内得到证实。单域抗体容易组装，易于在胞内表达，有人将抗HBV胞内抗体应用于小鼠模型中证实单域抗体具有胞内抗病毒治疗作用。

单域抗体便于进行基因工程操作，可以根据不同需求研发各种单域抗体。如为了减少成像检测中背景过深的问题，有学者将可以识别骨髓衍生细胞的单域抗体的环区转移到了一个背景较浅的单域抗体的骨架上，在动物体内的试验中成功降低了背景亮度，同时保留了单域抗体的识别能力。Coppieters等将筛选到的抗TNF单域抗体进行了融合成为了2价体，经过改造后亲和力提高了500倍，同时延长了体内的半衰期，在动物试验中得到了成功，如今已进入临床试验。

骆驼重链抗体来源的单域抗体虽然依然存在体内半衰期短，亲和力不如常规IgG抗体等缺点，但是瑕不掩瑜，有理由相信单域抗体具有走出实验室进入临床的可能。

参考文献

[1]KöhlerG,MilsteinC.Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.1975[J].JImmunol.2005;174(5):2453-2455.

[2]ReichertJM.Antibody-basedtherapeuticstowatchin2011[J].MAbs.2011;3(1):76-99.

[3]潘欣,潘伯驹,蔡家麟,李晗,王颖,蓝乐夫,廖万清.单域抗体研究进展.生命科学2012;24(5):404-410

[4]DeschachtN,DeGroeveK,VinckeC,RaesG,DeBaetselierP,MuyldermansS.Anovelpromiscuousclassofcamelidsingle-domainantibodycontributestotheantigen-bindingrepertoire[J].JImmunol,2010;184(10):5696-5704.

[5]TanakaT,RabbittsTH.Protocolfortheselectionofsingle-domainantibodyfragmentsbythirdgenerationintracellularantibodycapture[J].NatProtoc.2010;5(1):67-92.

基金资助:国家自然科学基金资助课题（30972633）