慢性应激抑郁模型大鼠脑内RES1mRNA表达水平的变化

何金花1黎毓光1刘誉2

(1广州市番禺中心医院广东广州510440)

(2暨南大学医学院生化教研室广东广州510632)

【摘要】目的观察慢性应激(chronicmildstress,CMS)抑郁模型大鼠局部脑区RES1（RattshomologofzebrafishES1）mRNA表达水平的变化，结合行为学改变，探讨RES1基因在抑郁发生、发展中的作用及抑郁的发病机理。方法将30只成年雄性大鼠随机分为对照组和慢性应激模型组，利用慢性不可预知的温和应激建立大鼠抑郁模型，正常对照组不予任何刺激，观察并比较两组大鼠行为学表现。提取大脑海马组织中的RNA，以GAPDH为内参照实时荧光定量RT-PCR方法检测大鼠大脑海马内RES1基因mRNA表达的改变。结果与对照组相比，慢性应激模型组大鼠活动能力下降，兴趣丧失，与临床抑郁症的精神抑制症状相似。模型组RES1mRNA表达水平低于对照组，两组间差异显著具有统计学意义(p<0.05)。结论RES1基因表达下调可能与抑郁症的发生和发展有关。

【关键词】抑郁症RES1基因实时荧光定量RT-PCR海马

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）12-0083-02

抑郁症的发病机制主要被认为是由于患者体内5-羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺等神经递质紊乱所致[1]。研究发现海马、前额皮质体积基因组学显示多个基因位点改变，没有找到单一的遗传模式[2]。这些观点都不能完全解释抑郁症的发病机制，也无从正确指导新的抗抑郁药物的开发和疾病的预防。人ES1基因定位于人的第21号染色体（C21orf33），mRNA序列全长为1.7Kb,编码的蛋白质含有238个氨基酸,与神经系统发育及精神病症有关[3]。因此，关于ES1的功能还没有最后定论，这也是它值得深入研究的理由之一。目前国内外未见关于它与抑郁症关系的研究。本研究旨在探讨大鼠大脑海马神经细胞内ES1基因表达的改变，进一步揭示抑郁发病的机理。

1材料和方法

1.1材料

（1）实验试剂与仪器TRIZOL试剂（Invitrogen公司），M-MLV逆转录酶（Promaga），Taq酶（TaKala），琼脂糖（Biowest）,Genefinder染料（MBI公司），RealMasterMix(SYBRGreen)北京天根，Beckmancounlteru260紫外分光光度计，EPPendorf梯度PCR仪（德国EPPendorf），Bio-RudPac200电泳仪（美国），GDS-8000凝胶成像分析系统（美国），Chromo400实时荧光检测系统（美国），Eppendorf高速冷冻离心机（德国EPPendorf）。

（2）实验动物成年雄性清洁级SD大鼠30只,体重250～300g，购于中山大学医学院实验动物中心（许可证号：SYXK（粤）2007-0081）。实验前适应性饲养一周,其间自由进食、饮水,保持室内通风,室温维持在(20±2)℃，将大鼠随机分成对照组和实验组，每组15只，单笼饲养。造模前用敞箱实验(openfieldtest)进行行为学评分一次。

1.2实验方法

（1）大鼠慢性应激抑郁模型的制备将明暗颠倒24h、4℃冰水游泳2min、水24h、停食24h、夹尾1min、30v电压电击足底5s、水平震荡5min(160Hz)、40℃环境5min、空瓶刺激以及噪声干扰，共10种刺激随机安排到27日内，每日一种,每种刺激出现3次,同种刺激不能连续出现，使动物不能预料刺激的发生。对照组不予任何刺激，上述各组处理均至第27天，其间进行行为学实验，在第28天,即末次处理24小时后，对模型组和对照组进行各项指标的比较。

（2）行为学测定：用敞箱实验(openfieldtest)进行行为学评分.采用的敞箱为立方体,高为45cm，长宽各为90cm，周壁为黑色，底面由面积相等的30个方块组成以大鼠穿越地面方格块数为水平运动得分，大鼠穿越1格(3爪以上跨入)为1分；以直立次数(2个前爪腾空或攀附墙壁)为垂直运动得分，双足离地一次计1分；两者之和为敞箱总得分。每只大鼠进行1次，每次时间为3min，分别由两名实验人员记录两组大鼠清洁运动次数(大鼠做洗脸样动作)。测定时间为每天下午五时，持续进行3天的评分,并记录大鼠的死亡情况。

（3）实时荧光定量RT-PCR：总RNA的提取及逆转录反应大鼠断头处死,低温下分离左右端脑，取海马组织0.25g,运用运用Trizol试剂提取脑组织RNA，然后进行逆转录反应得到CDNA。RES1引物序列为；上游引物5’-TGTGAAGGGTGTGACCGAAG-3’，下游引物：5’-GTGGTGCTGGTGGTGTTACT-3’（189bp），GAPDH引物序列：上游引物:5’-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物：5’-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3’(272bp)25μl的反应体系：模板1μl，上下游引物各1μl，11.25μl的SYBRgreen混合染料,补足无RNA酶的水至25μl。混匀后，放入热循环仪中进行反应。条件设置如下：95℃15s预变性，95℃4s,60℃15s，72℃15s共45个循环。所有的样本检测均包含一个不加模板的阴性对照，以排除假阳性的结果。参照LIVAK等[4]设计的一种比较阈值法来测定目的基因的相对表达量。他们根据数学公式推导得出目的基因的量=2-△△CT，在该公式中，Ct代表CYCLethreshold,CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数，△△Ct=（Ct目的基因-Ct管家其因）对照组-（Ct目的基因-Ct管家其因）实验组。运用计算2-△△Ct值来比较对照组和实验组的mRNA的相对表达量的差异，以ΔCt值（x-±s）为定量结果进行统计分析。

1.3统计学处理：采用SPSS13.0软件包进行统计分析，方差齐时组间比较采用t检验，方差不齐，运用两样本均数比较的秩和检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1两组大鼠行为学的比较

应激4周后,实验组大鼠水平运动、垂直运动得分,总得分.及清洁动作次数较对照组明显降低,具有统计学意义，其得分符合抑郁模型。

表１两组大鼠应激前后行为学变化（x-±s、n=15）

2.4实验组和对照组RES1基因表达水平的比较

本实验我们根据对照组RES1和管家基因GAPDH的ct值，可以计算出对照组RES1基因的表达相对于实验组RES1的变化倍数，根据公式得出对照组RES1基因的表达相对于实验组RES1基因的表达的9.94倍。由此可以准确的得出RES1基因在慢性应激抑郁模型组中较对照组中表达要弱。表2列出了RES1基因在实验组和对照组大脑组织中的相对表达量。实验组较对照组比较（P=0.000、t=189.23）具有统计学意义。

表2RES1基因在对照组和实验组的比较

3讨论

本实验运用慢性轻度不可预见性应激去剌激大鼠,其理论依据与人类抑郁症中慢性、轻度的应激导致抑郁症的发生、发展机理极为相近、本研究模型组大鼠各项得分较对照组明显降低,也正反映了反复应激可能让大鼠处于了抑制状态;慢性应激抑郁模型经历了多种低强度刺激,其病因和病理机制比其它模型更接近于人类抑郁症,这与抑郁症临床诊断中的精神运动改变有一定程度的相似性,提示该模型是较理想的抑郁动物模型[5]。

本实验通过建立大鼠抑郁模型，低温下分离大脑海马组织，提取RNA，首次以大鼠RES1为引物,以GAPDH为内参本研究采用实时定量PCR技术，使PCR扩增和终产物检测全处于封闭的条件下进行，相比传统PCR相比不仅操作简便、快速高效，而且具有很好的敏感性和特异性，能分析微量物质的基因表达水平,且本实研不断优化条件，从电泳产物图和溶解曲线图可以看出目的基因的扩展具有很好的特异性。在以内参照物和目的基因扩展效率一致的前体条件下，应用比较ct值法来来对分析mRNA表达水平的差异。研究结果表明;大鼠在接受长期慢性温和刺激后，其大脑海马组织中RES1基因表达较对照组较低，具有统计学意义。

总之，本研究首次发现RES1基因在慢性应激抑郁模型大鼠海马神经元细胞内表达下调，将为进一步研究HES1基因的功能奠定了基础，也为探讨抑郁症发病分子生物学机制提供了线索。

参考文献

[1]李晓晶,马欣欣.抑郁症发病机制与药物治疗研究进展[J].河北医药,2006，34(2):132-136.

[2]牟君,谢鹏.海马神经发生障碍--抑郁症发病机制的新观念[J].第三军医大学学报,2006,32(5):1264-1266.

[3]陈静,陆峥,江三多.细胞色素P450酶1A2和2C19基因多态性与难治性抑郁症的关联分析[J].上海精神医学,2005,5(2):95-98.

[4]LIVAKJ,SCHMITTGENTD.analysisofrelativegeneexpressionindatausingreal-timequantitativePCRandthe2-△△CTmethods.Methods,2001,25(4):402-408.

[5]XUJing,LIXiao-qiu.Theestablishmentandevaluationofchronicunpre-dictablemildstressdepressionmodel.ChineseJournalofBehavioralMedicalScience,2003,12(1):14-17.