非小细胞肺癌患者胸水标本 EGFR基因突变检测分析

刘芳芳，陈智伟，祁晓育

摘要：目的 探讨EGFR突变在NSCLC患者胸水中的检出率及突变与NSCLC患者临床病理参数的关系。方法 收集莆田学院附属医院2016年5月至2019年11月NSCLC患者送检的胸水113例，ARMS PCR检测EGFR基因状态。结果 NSCLC胸水标本中驱动基因总突变率为58.41%，EGFR-TKI敏感突变为53.10%，其中19-Del突变率为28.32%，L858R突变率为19.47%，T790M突变率为3.54%。结论 NSCLC胸水标本的EGFR基因突变检测可以用于临床指导NSCLC的靶向治疗。

关键词：胸水；非小细胞肺癌；ARMS PCR；EGFR

肺癌已经成为临床上最常见的恶性肿瘤，现居癌症死亡原因的第一位^[1]，其中约85%为非小细胞肺癌^[2]（NSCLC）。随着分子病理诊断技术的高速发展以及非小细胞肺癌驱动基因的靶向治疗获得的明显的疗效，其驱动基因状态的检测成为了NSCLC靶向治疗的指向性指标，包括EGFR、c-MET、KRAS、BRAF基因突变、ALK和c-ROS-1融合/重排、及免疫治疗指标PD-1和PD-L1等^[3]，其中EGFR是NSCLC治疗的重要靶点。部分无法获取组织标本的患者产生的恶性胸水是其驱动基因状态检测的首选目标。

1材料与方法

1.1材料 收集本院2016年6月至2019年11月送检的NSCLC恶性胸水113例，所有样本均制备成细胞块，HE及免疫组化染色，由莆田学院附属医院病理科副主任医师明确诊断为NSCLC。

1.2 方法

1.2.1 细胞块的制备 胸水送检后，静置30min，弃部分上清，将剩余部分摇匀，取45mL于50mL离心管中，3000r/min离心5min，弃上清，加入10%中性缓冲福尔马林45mL悬浮固定2h，3000r/min离心5min，弃上清，取出细胞团，棉纸包裹后脱水包埋制成细胞块。

1.2.2 核酸提取及相关基因检测 将细胞块各切取5卷5μm的石蜡卷于1.5mLEP管中，加入1mL二甲苯震荡至石蜡完全溶解，12000r/min离心2min，加入1mL无水乙醇，12000r/min离心2min，弃上清，按照石蜡组织标本DNA提取试剂盒（厦门艾德生物医药科技股份有限公司）说明书提取细胞块基因组DNA。Amoydx - Gimffe紫外分光光度计检测DNA浓度和质量。对提取的核酸样本按照EGFR基因突变检测试剂盒（厦门艾德生物医药科技股份有限公司）说明书以2ng/μL浓度于Light-cycle 480 PCR仪上机检验。

1.2.3 统计学分析 采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计数资料采用卡方检验或Fisher’s精确检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1 EGFR基因突变在NSCLC中的表达情况

NSCLC胸水标本中驱动基因EGFR总突变率为58.41%（66/113），EGFR敏感突变为53.10%（60/113），其中19-Del突变率为28.32%（32/113），L858R突变率为19.47%（22/113），T790M突变率为3.54%（4/113）（表1）。

表1 EGFR基因突变的表达情况
突变类型	例数	百分比（%）
总数	113
19-Del	32	28.32
L858R	22	19.47
20-INS	2	1.77
G719X	2	1.77
L861Q	2	1.77
Del+T790M	3	2.65
L858R+T790M	1	0.88
G719X+S768I	2	1.77
WT	47	41.59

2.2 EGFR基因突变与NSCLC临床病理参数的相关性分析

经统计学分析显示，在本组NSCLC恶性胸水样本EGFR突变检测数据中，EGFR突变与患者的年龄、性别相关，差异具有统计学意义（p<0.05），与肿瘤大小无关(p˃0.05)（表2）。

表2 EGFR基因突变与NSCLC临床病理参数的关系
					变量	例数	EGFR野生型	EGFR突变型	P值
样本量	113
EGFR突变情况	113	47	66
年龄
<55	15	8	7	p<0.05
≥55	98	39	59
性别
男	48	24	24	p<0.05
女	65	23	42
肿瘤大小
≥3 cm	37	15	22	P˃0.05
<3 cm	38	17	21
未知*	38
*未知样本未包含在统计学分析之中；肿瘤大小：按照患者CT检测报告肿瘤最大径定义。

3讨论

近年来，肺癌的发病率和死亡率逐年增加，已经成为临床上最常见的死亡原因^[5]，其中大部分为NSCLC。超过50%的患者被诊断为NSCLC时已经为ⅢB和Ⅳ期，已经失去根治治疗的机会^[6]，这部分患者病理诊断的依据主要来源于穿刺和脱落细胞学的检查，甚至部分患者无法耐受穿刺检查，脱落细胞学检查成为了首选检测标本。随着个体化治疗的发展，大部分NSCLC患者可以从EGFR敏感突变的靶向治疗中获益，并且副作用较小。EGFR-TKI已经成为NSCLC患者EGFR敏感突变的首选用药。我们通过分析本院收集的NSCLC胸水标本中EGFR突变情况探讨EGFR突变在NSCLC患者胸水中的检出率及其突变与NSCLC患者临床病理参数的关系。分析结果显示，本组数据NSCLC胸水标本中EGFR总突变率为58.41%，EGFR-TKI敏感突变为53.10%，其中19-Del突变率为28.32%，L858R突变率为19.47%，且EGFR突变与患者的年龄、性别相关。Pioneer曾报道在ⅢB和Ⅳ期的NSCLC组织学标本中EGFR基因突变率为51.4%^[7]，且已有临床报道EGFR驱动基因在女性肺腺癌患者中有较高的突变率，主要为19-Del和L858R突变^[8]，与本组数据分析结果相符合。因此，NSCLC恶性胸水标本可以用于肺癌驱动基因的检测，临床指导肺癌的靶向治疗。

参考文献

[1][4] 王汉萍,张力.非小细胞肺癌免疫治疗的最新进展[J].癌症进展,2014,12(03):250-255.

[2] 赵沙,蒋涛,周彩存.抗PD-1/PD-L1免疫治疗疗效预测标志物在非小细胞肺癌中的研究进展[J].肿瘤,2016,36(07):823-828.

[3] 高元明,朱光发,肖瑶,等.非小细胞肺癌基因变异分子诊断及治疗进展[J].心肺血管病杂志,2017,36(09):740-741+744.

[5] Schrump DS, Altorki NK, Henschke CL, et al. Non-small cell lung cancer. In: DeVita VT, editor. Cancer: Principles and Practices of Oncology. Philadelphia:Lippincott Williams & Wilkins;2005.pp.753-810.

[6] Shi Y,Au J S,Yang P C,et al.A prospective,molecular epide-miology study of EGFR mutations in Asian patients with advanced non-small-cell lung cancer of adenocarcinoma histology ( PIO- NEER). J Thorac Oncol,2014,9( 2):154-162．

[7] 冯佳,许斌,宋启斌.EGFR19与21号外显子突变的晚期非小细胞肺癌一线TKI治疗疗效差异的研究进展[J].肿瘤学杂志,2016,22(03):167-171.