高产木糖醇酵母菌的筛选鉴定及两级法发酵特性

田瑞新 1 李骥鸿 1 王德信 1 张娟 1 张伶 2 薛方锁 2 胡延贝 2

摘要：木糖醇是一种低热量的戊糖醇，在自然界中分布广泛，蔬菜、水果、蘑菇等中都有发现。同时也是人体糖类代谢的一种中间代谢产物，每天正常的新陈代谢产生木糖醇。近年来，由于其高甜度、低热量和防龋齿的特性，已引起人们的重视。当今，木糖醇的规模化生产主要是在镍的催化下木糖加氢还原制造，成本相对较高，生产安全性差，而微生物生产木糖醇成本低、工艺条件温和，已经引起人们的关注。目前，由于缺乏高效率生物 转化木糖生成木糖醇的优良菌株，制约了微生物发酵法生产木糖醇技术的产业化进程。因此，获得优良菌株、优化发酵工艺控制仍是生物转化木糖醇生产研究的重点。

关键词：高产木糖醇酵母菌；筛选鉴定；两级法发酵特性；

由基因工程手段进行菌种改进过程复杂，周期长，技术要求高，且突变菌的筛选和鉴定比较困难．条件优化也可以一定程度上提高目的产物的转化率，但提高的程度有限。因此从自然界筛选出耐高底物浓度的木糖醇高产菌株成为一种快速实用的手段。木糖醇作为一种天然存在的五碳糖醇，可以作为替代糖，木糖醇可以有效抑制造成龋齿形成菌的代谢从而防止龋齿的形成，它可以降低变性链球菌从母亲传向子代的几率，其体内代谢不需胰岛素参与，可用作葡萄糖替代物。

一、木糖醇的生理效应

木糖醇参与人体内糖类代谢，通过磷酸戊糖途径生成6-磷酸葡萄糖再合成糖元，或者生成3-磷酸丙糖，然后进入EMP途径，生成丙酮酸，代谢生成能量、二氧化碳和水。在代谢过程中不依赖胰岛素，不增加血糖和尿糖，还能适当的刺激少量胰脏分泌。对一些糖代谢异常的病人来说 可以作为糖替代品。自然界中能利用木糖醇的微生物很少，这就赋予了木糖醇具有一定的防腐功能，作为糖类替代物添加到食品中可以适当的延长其保质期，有助于食品保藏[ 。另外木糖醇不易被龋齿微生物利用产生酸性物质，因此还具有 防龋功能。但是木糖醇不易被肠胃里的酶分解，在消化道内吸收比较慢，所以如果食用过多的木糖醇，会引起肠胃不适，容易造成腹泻。木糖醇还能促进肝糖元的合成，提高葡萄糖转化率。降低转氨酶促进氨基酸的吸收，减轻肝脏的负担，起到治肝、护肝、保肝作用。当人食用过多的高脂食品或脂肪代谢异常时，会使血液中的酮体积累，严重时会引起中枢神经系统中毒，致使晕厥，甚至死亡。木糖醇在抗酮体方面表现出较强的能力，在血液中能有效的阻止酮体体的产生，常被用来抢救高酮患者，有较好的疗效。木糖醇本身并没有抗菌作用，近年来有研究报道表明木糖醇有作为辅助治疗剂防治人体内肺膜和呼吸道感染的作用。人的肺部黏膜和支 气管表面的黏液是为防止有害微生物入侵的屏障。若这道屏障盐度增加，有害微生物就会乘虚侵犯，引起呼吸系统感染。患者食用木糖醇后，呼吸道和肺部黏液高盐度很快降低到正常水平，从而起到抑制有害病菌的生长得作用，故有利于恢复或预防呼吸系统感染。木糖醇还降低血脂、胆固醇的功能。木糖醇在人体内吸收慢，分布广，代谢不依赖胰岛素，食用后能够有效的控制了热量贮存。长期食用能够起到降低肥胖患者体重的作用。为预防高血糖高血脂高血压起到很好的作用 [ 。木糖醇可以改善肠道内微生态环境，促进有益菌群的增殖。另外还可以促进胃液 的分泌，调节消化代谢途径。所以木糖醇可以作为改善肠胃功能的功能性添加因子。

二 高产木糖醇酵母菌的筛选鉴定及两级法发酵特性

1.高产木糖醇酵母菌的筛选鉴定。微生物发酵法生产木糖醇以其条件温和、操作简便、副产物少、环境污染低、纯化和分离步骤少等优点成为一个引人瞩目的研究课题，吸引了国内外专家学者对其进行了深入的研究。据报道，一些酵母菌、细菌以及某些真菌能将木糖转化生成木糖醇。其中 酵母菌是最有前景的木糖醇生产菌。但根据一些研究报道，酵母菌对较高浓度的木糖初浓度耐受能力较弱及木糖醇产率低，所以目前虽然生物转化木糖醇有各种优点，但至今没有实现工业化生产。很多学者致力于寻找木糖醇生物转化优良菌株。近几年不断有研究者通过从自然界中筛选、克隆、转基因等手段获得高产菌株。菌种的性能是发酵工业的关键，菌种性能直接影响着微生物代谢生产能力、发酵生产的成本以及产业化扩大生产的难易程度等。工业生产上的优良菌种大多是从自然界中分离得到，并经过分离纯化及培养成分和培养条件进行研究而最终应用于工业生产的。目前，木糖木糖醇转化率和木糖醇产率是限制微生物转化生产木糖醇规模化的关键因素，因此筛选出一株性能优良的高产木糖醇菌株显得非常重要。在自然界中能够单独利用木糖的菌株比较少，找到能够耐受高浓度木糖，并且获得木糖醇高产的目的菌株，需要进行大量的筛选工作，因此需要建立一种简便快捷的筛选方法来提高筛选效率。自然界中的腐烂秸秆中所含有的丰富半纤维素经过长时间的转化必定能部分转化为木糖。所以首先选择在富含腐烂落叶，秸秆等半纤维素较多，比较肥沃的土壤里选取土样。在筛选木糖醇生产菌株中，能够耐受高渗条件是必要条件之一，因为只有提高木糖初始浓度才能提高发酵液中木糖醇的产量，从而降低成本。然后选择进行产物快速定性的方法，尽快找到目的菌株。试验中首先选择能够在以木糖为唯一碳源并在高渗条件下能够生长的菌株。分离纯化后进行初筛，初筛中选择简便快捷，花费比较低的纸层析方法通过纸层析进行对菌株产物进行初步鉴定，选择有木糖醇斑点的菌株，然后利用折光仪检测发酵液中的固形物，DNS测定发酵液中木糖残余量，选择木糖残余量较少，木糖醇斑点相对明显的菌株。复筛的时候利用高效液相色谱对产物进行定量，定性。最后选择木糖利用率，木糖醇产率均较高的菌株。然后根据菌体的形态特征，生理生化试验及 序列测定对菌体进行初步鉴定，并利用红外吸收光谱对菌体代谢产物进行准确定性。

2.两级法发酵特性。温度是影响菌体生长繁殖和代谢产物积累的一个非常重要的因素。具相关文献报道酵母利用木糖最适温度一般在30℃左右，不同的微生物对不同的温度适应程度不同，温度影响菌体在代谢目的产物关键酶的活性。温度过低或者过高会影响菌体内酶活性、氧气和其他营养物质的传质速率从而影响代谢产物的积累。添加葡萄糖作为辅助碳源是影响酵母发酵木糖生产木糖醇的一个关键因素。在发酵过程中葡萄糖首先被消耗，并且消耗速度比木糖快很多。如果添加葡萄糖作为辅助碳源，菌体首先消耗葡萄糖用作菌体生长繁殖，同时提供木糖还原酶所需要的辅酶 NADPH, 这样可以减少对木糖的消耗，同时提高木糖醇转化率。木糖醇的实际转化率有可能达到或超过理论转化率。醇的产量并且在发酵过程中还有酒精生成。从整个发酵进程上看，菌体在发酵过程中耗氧量特别大，通氧量过大有利于菌体生长，大量消耗木糖使木糖醇转化率下降。通氧不足时酵母菌株。

本文表明该菌株具有良好的木糖和木糖醇耐受性，和较高的木糖转化效率，具有很大的应用潜能．两级法发酵对于提高木糖的转化效率有积极作用，因而可以作为提高微生物转化效率的有效手段．

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