项目来源：深圳市福田区卫生公益性科研项目，编号 FTWS2017036

丁香酚、小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌作用及机制研究

单位：广州中医药大学深圳医院（福田） 广东 深圳 邮编：518034

项目来源：深圳市福田区卫生公益性科研项目，编号FTWS2017036

【摘要】目的：分析研究丁香酚、小檗碱与氟康唑协调抗耐药白念珠菌的作用，为验证两种中药单体抗真菌及逆转耐药作用提供参考及借鉴。方法：采集2017年8月~2018年7月外阴阴道念珠菌病患者菌株，筛选耐药真菌20株，并对菌株分别给予氟康唑、丁香酚联合氟康唑、小檗碱联合氟康唑，观察分析不同情况作用于耐药白念珠菌后真菌结构变化，并判断联合用药是否为协同作用。结果：真菌结构变化：丁香酚联合组及小檗碱联合组均出现细胞的空泡现象及线粒体空泡，细胞壁消失更多，靠近细胞膜处有不明物质堆积且与细胞质界限清楚，且出现包浆肿胀现象。真菌细胞膜麦角甾醇含量下降。丁香酚与氟康唑、小檗碱与氟康唑均为协同抗药作用，协同指数FICI＜0.05。结论：丁香酚、小檗碱与氟康唑联合针对耐药白念珠菌具有协同抑菌作用，可以起到抗真菌及逆转耐药作用。

【关键词】白念珠菌；耐药白念珠菌；丁香酚；小檗碱；氟康唑

白色念珠菌为人体阴道、胃肠道、口腔及皮肤的正常菌群，为条件性致病菌。目前由于临床上抗生素、免疫抑制剂的广泛使用，加之有创性治疗方法的应用，静脉营养等，导致白色念珠菌感染率有明显的上升^[1]。目前临床研究中发现，丁香酚和小檗碱均具有一定的抗真菌作用，因此，研究对临床分离的耐药菌株进行探究，通过体外实验，探究丁香酚、小檗碱与氟康唑对耐药白念珠菌的协同抑制作用，并探究其机制，报告如下：

1资料与方法

1.1研究资料

1.1.1资料来源及分组

采集2017年8月~2018年7月外阴阴道念珠菌病患者菌株，资料来源为我院皮肤性病科及妇科门诊的念珠菌病患者，筛选耐药白念珠菌，将纯化培养菌株经过YST酵母菌鉴定确认，并使用ATB-FUNGUS3开展药敏试验，并留取氟康唑耐药菌株。患者年龄为19~49岁之间，平均为30.02±5.32岁，均有性生活史，已婚11例，已育9例。

1.1.2纳排标准

纳入标准：（1）年龄在18岁以上；（2）患者表现为外阴瘙痒和灼痛，白带增多，性交痛尿痛；（3）有外阴潮红和水肿，可见白色豆渣样分泌物，有凝乳状^[3]；（4）实验室经过真菌涂片镜检有假菌丝等情况；

排除标准：（1）近3个月内有系统抗真菌药物治疗史；（2）长期使用皮质类固醇及免疫抑制剂；（3）哺乳期及妊娠期；（4）近1个月内经过放疗及抗病毒治疗；（5）近1个月内经过抗菌及抗螨虫治疗；（6）合并心血管、肝肾疾病，血液系统疾病及恶性肿瘤。

1.2方法

对临床分离的20株耐药菌株进行培养，转种分离后分别使用氟康唑、丁香酚联合氟康唑、小檗碱联合氟康唑对上述耐药白念珠菌进行作用。分别对作用前和作用后的菌株的相关指标进行测定和统计分析。

1.3观察指标

观察分析不同情况作用于耐药白念珠菌后真菌结构变化，并测定真菌细胞膜麦角甾醇含量观察抑制情况，对真菌细胞膜外排蛋白功能变化进行分析。并判断联合用药是否为协同作用，抑菌指数为FICI判断联合效应，其中FICI=MIC^A联合/MIC^A单独＋MIC^B联合/MIC^B单独，若出现FICI为0.5及以下为协同作用，若FICI在0.5~1（包括1）为相加作用，若FICI在1~4（包括4）为无关作用，FICI在4以上为拮抗作用^[4]。

耐药基因表达情况：使用实时荧光定量PCR检测方法对耐药菌株基因进行测定，包括CDR1、CDR2、MDR1。

1.4数据处理

所有白念珠菌菌株数据均进行准确核对和录入，采用SPSS17.0 for windows软件进行统计学处理。

2结果

2.1真菌结构变化

氟康唑组细胞壁变薄或消失，出现核质稀疏；丁香酚联合组及小檗碱联合组均出现细胞的空泡现象及线粒体空泡，细胞壁消失更多，靠近细胞膜处有不明物质堆积且与细胞质界限清楚，且出现包浆肿胀现象。

2.2麦角甾醇含量

氟康唑组对麦角甾醇合成影响不大，丁香酚联合组、小檗碱联合组麦角甾醇（Ergosterol-5,24(28)-dien-3-0l及Ergosterol-7,22-dien-3-ol）含量下降至未检出，Ergosterol-8,24(28)-dien-3-ol分别为4.21±1.09、4.98±1.33，低于氟康唑组，p＜0.05，差异有统计学意义。丁香酚联合组及小檗碱联合组均出现羊毛甾醇含量积累，高于氟康唑组，p＜0.05，差异有统计学意义，丁香酚联合组及小檗碱联合组麦角甾醇及羊毛甾醇对比差异不明显，p＞0.05，差异无统计学意义。见表1

表1.三组菌株麦角甾醇及羊毛甾醇合成情况

组别	例数	Ergosterol-5,24(28)-dien-3-0l	Ergosterol-7,22-dien-3-ol	Ergosterol-8,24(28)-dien-3-ol	14α-Methyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3β-ol
氟康唑组	20	9.87±3.12	5.09±2.31	20.971±7.21	13.21±3.61
丁香酚联合组	20	0.00±0.00	0.00±0.00	4.21±1.09	37.21±5.32
小檗碱联合组	20	0.00±0.00	0.00±0.00	4.98±1.33	38.91±6.09
F		7.312	6.091	11.321	19.372
P		0.000	0.000	0.000	0.000

2.3外排基因表达变化

丁香酚联合组、小檗碱联合组均导致CDR1mRNA、CDR2mRNA及MDR1mRNA的表达水平降低，与氟康唑组对比差异明显，p＜0.05，差异有统计学意义，但两组联合组对比差异不明显，p＞0.05，差异无统计学意义。见表2

表2.三组菌株CDR1mRNA、CDR2mRNA及MDR1mRNA的表达水平

组别	例数	CDR1mRNA	CDR2mRNA	MDR1mRNA
氟康唑组	20	2.33±0.12	2.61±0.33	2.44±0.18
丁香酚联合组	20	0.88±0.18	0.76±0.11	0.61±0.08
小檗碱联合组	20	0.79±0.24	0.80±0.09	0.72±0.12
F		8.982	9.445	11.212
P		0.000	0.000	0.000

3讨论

本研究为分析丁香酚、小檗碱与氟康唑联合对耐药白念珠菌的影响，从多方面入手分析，包括联合用药后的细胞结构变化，麦角甾醇变化，基因表达情况等，并研究了药物是否为协同作用。从结果中可以看出，丁香酚联合组及小檗碱联合组均出现细胞的空泡现象及线粒体空泡，细胞壁消失更多，靠近细胞膜处有不明物质堆积且与细胞质界限清楚，且出现包浆肿胀现象。丁香酚与氟康唑、小檗碱与氟康唑均为协同抗药作用，协同指数FICI＜0.05。充分说明了丁香酚与小檗碱联合氟康唑效果显著，可以从多方面破坏真菌细胞，如细胞膜、麦角甾醇失活等等，进而达到杀灭真菌的效果。

综上所述，丁香酚、小檗碱与氟康唑联合针对耐药白念珠菌具有协同抑菌作用，可以起到抗真菌及逆转耐药作用。

【参考文献】

[1]李翠,吴永琴,陈艺升,等.白念珠菌临床分离株吡咯类耐药机制研究[J].中国感染与化疗杂志, 2017,17(4):397-403.

[2]孙康德,陈铖,陈旭,等.口腔白念珠菌耐药性与基因分型及耐药基因表达的分析[J].检验医学, 2017,32(11):979-984.

[3]刘秀卿,王革非,李卓成,等.PCR-反向点杂交法在外阴阴道念珠菌病诊断及白念珠菌耐药基因突变检测中的应用[J].临床检验杂志,2017,35(7):495-498.

[4]王玉连,张璐璐,秦玉璘,等.利福喷丁对氟康唑体外抗耐药白念珠菌的增效作用[J].中国真菌学杂志,2016,11(3):156-159.