家畜消化道菌群的分子生物学研究方法

范鑫，张彦斌，马胜男，张宏博 *

摘要：现阶段，随着社会的发展，我国的各行业的发展也有了创新。消化道菌群多样性对于维持家畜机体健康起着至关重要的作用，因此，对家畜消化道中定植菌群的种类和功能进行分析就显得尤为关键。由于所有动物的消化道是厌氧环境，所以在体外的好氧环境中，有些菌种不易培养，而这些菌种信息的缺失，会导致消化道优势菌群的分析结果出现偏差。借助一些广泛应用的分子生物学研究方法，可以避免这种情况的发生。这些方法主要是测序法和定性定量分析法。测序法包括指纹图谱法和高通量测序法，定性定量分析法包括荧光原位杂交法和实时荧光定量PCR法。这些方法均基于分子生物学水平，可避免菌体培养步骤，直接分析消化道菌群的组成和功能。综述了上述方法的原理以及各自的优点和缺点，并对它们在动物消化道菌群多样性分析中的应用进行了讨论，以期为研究动物消化道微生物时不同分子生物学方法的选择和联合使用提供参考。

关键词：家畜消化道菌群；分子生物学 ；基因组；

引言

“共生生命体（holobiont）”是为描述由片利共生和互利共生以及宿主相关微生物菌群组成的脊椎动物超有机体创造的术语。宿主要发挥出其最大的遗传潜力可能需要肠道微生物菌群之间的完美平衡，事实上似乎任何一种脊椎动物都可能拥有共同进化的基因组和它的微生物组。肠道微生物菌群在肠道内构建了一个会对宿主的许多机体功能产生影响的复杂环境。这些微生物对动物机体的影响包括黏蛋白的降解、控制病原体的丰度和行为、调节炎症以及刺激肠道的分化和发育，等等。在食品生产用动物的生产中，用于操控肠道微生物菌群的策略有很多，其目的都是影响营养物质的消化和吸收。另外，动物抵抗人畜共患病病原体的感染和定植的能力可能会受到肠道微生物菌群的影响。增加肠道有益微生物丰度的常用方法包括使用直饲型微生物（如益生菌）和益生元添加剂，以给动物饲喂所需要的微生物。竞争排斥性产品和抗菌剂也被用于抑制肠道中有害微生物的丰度[1]。由于消费者希望获得更多来源的“健康”的肉类、家禽和蛋类，生产者对有效应用此类方法的兴趣正在增加。现有的文献证明人们对与宿主相关的微生物生态学领域的研究正大幅增加。从实验室和现场实验中获得的经验教训将能够使我们最大限度地提高家禽的产量和动物的健康水平。将分子工具和传统培养技术结合起来以研究肠道生态系统，使我们能够揭示影响全息生物功能的相互作用。

1评估肠道菌群

即使对分析现场试验或商业生产条件下的肠道菌群组成非常感兴趣，例如为了评估养殖场的卫生状况或验证干预手段（例如使用益生菌）的有效性，然而实际应用是非常困难的。

粪便菌群可以反映胃肠道菌群组成，根据这一事实，拉曼公司开发了一种方法，通过分析家禽粪便中的微生物组成来评估消化道菌群的状态。

有两个标准可用于评估粪便菌群：

常见病原菌（大肠杆菌、沙门氏菌和肠杆菌）和总乳酸菌（乳酸杆菌或乳酸菌）的菌落计数（CFU计数），以及这些菌随着时间推迟发生的进化。

“好”细菌（乳酸杆菌）和“坏”细菌（肠杆菌或梭菌）的比值：比值越高越好。

分析粪便菌群组成是一个快速简单的指标，能同时反映胃肠道的菌群平衡和养殖场的卫生状况。实际上，粪便代表了养殖场病原菌谱的主要部分，是交叉污染的来源，也是食源性致病菌（沙门氏菌、大肠杆菌和梭菌）通过垫料或粉尘传播的潜在载体。

在用益生菌进行干预的情况下，与最终评价养殖生产性能相比，评估粪便菌群组成可作为一种短期的评价手段。

2优化措施分析

2.1 PCR-DGGE电泳法

PCR-DGGE技术的原理是基于不同菌体的16S rDNA基因中可变碱基序列的差异，使具有相同长度但是不同序列的DNA片段得到分离。操作方法为：将待测基因片段加入浓度由高到低的、含有变性剂----尿素和甲酰胺的PAGE梯度凝胶中进行电泳，当待测片段迁移到合适的变性浓度时，片段中的DNA分子开始解链；由于不同序列的DNA分子具有不同的解链特性，其在凝胶中的电泳速度不同，解链后的片段随即停在具有这一浓度的凝胶中，利用包含不同序列的待测片段在凝胶中停留位置的差异，达到在凝胶中分离的目的。PCR-DGGE技术已经广泛应用于不同种属动物的肠道微生物研究中[2],利用PCR-DGGE技术研究了日粮对蛋鸡肠道的影响，在完成对蛋鸡肠道菌群16S rDNA的扩增后，发现肠道食糜的pH值和胃蛋白酶对蛋鸡肠道微生物区系有很大影响。利用DGGE图谱分析，通过对16S rDNA V2~V3可变区的扩增研究了新生仔猪肠道菌群的变化，发现在新生仔猪的空肠中有6个主要条带，这些条带与罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri）、卷曲乳酸杆菌（Lactobacillus crispatus）和德氏乳酸杆菌（Lactobacillus delbrueckii）的相似度可达95%左右；而在结肠中，DGGE图谱则为7个主要条带，经比对，这些条带与嗜淀粉乳酸杆菌（Lactobacillus amylovorus）、德氏乳酸杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillusreuteri）、Lactobacillus sobrius和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的相似度达到90%，这些数据很好地分析了新生仔猪的肠道菌群变化。PCR-DGGE技术作为一项微生物基因研究技术，具有灵敏性高、速度快和精确性高等特点，在分析动物肠道菌群变化和多样性、菌种鉴定以及优势菌的分离等方面得到了广泛的应用。但是PCR-DGGE技术在对菌群的研究上仍存在许多不足，其手段也有局限性，故应与其它分子技术相结合，如测序技术和分子杂交技术等，从而使动物肠道菌群得到综合的分析。

2.2高通量测序法

高通量测序法（high-throughput sequencing）被称为“下一代”测序法（next generation sequencing，NGS）。不同于传统的Sanger测序，它可以对很小的片段完成测序，且测序过程中不需要构建基因文库。对于数据的分析，该方法具有高解析度和高输出量的特点，得到的测序结果包括整个微生物群落的信息，且可以对复杂样品进行菌群的多样性分析以及相关的分类学鉴定。高通量测序包括宏基因组测序、全基因组测序和基于16S、18S、ITS rDNA等扩增子的测序。在这些高通量测序方法中，宏基因组测序是从宏观的角度，对整个肠道微生物组开展研究，过程主要是：先从样本中提取全部菌体的DNA，然后利用提取出的所有的DNA信息构建一个宏基因组文库，利用基因组学的方法，研究样本中包含的全部微生物的组成及其群落功能。基于宏基因组学的特点，利用鸟枪法宏基因组测序，研究了食草、食肉和杂食3种不同饮食类型的哺乳动物肠道菌群组成的差异，并对这些菌的功能加以研究，结果发现饮食方式对不同遗传背景的哺乳动物肠道微生物具有相似的影响，与此同时，完成了对这些菌群基因功能的预测。总之，高通量测序技术已经广泛应用于肠道微生物研究领域，使肠道微生态的研究真正达到了对整个肠道菌群结构的覆盖，同时，也能够对这些菌群的功能进行全面研究。但是，高通量测序技术只能对所研究样本中微生物的相对丰度进行分析，不能得到样品中某些特定微生物的数量，而实时荧光定量PCR技术则可以很好地解决此问题。此外，高通量测序技术需要对数据进行复杂的分析，这也是开展此项工作需要面对的挑战之一。

2.3基因芯片技术

基因芯片（genechip），又名DNA微阵列或DNA芯片，是指按照设定好的位置将数千万个核酸分子固定在面积很小的载体上后共同组成的探针阵列。基因芯片基于核酸分子杂交原理，并以此作为定性及定量分析的工具，具有准确、高效和灵敏等优点，能够综合地对肠道微生物进行分析。目前已在相关领域被广泛使用，尤其在微生物鉴定和检测方面，其优势尤为突出[4]。具体来看，基因芯片主要应用的领域是基因表达分析、新基因发现、基因组测序、基因文库作图、突变体检测和疾病诊断等方面。对于一些由细菌感染引起的动物疾病有很好的诊断效果。利用基因芯片鉴定出4种动物肠道常见的致病菌，这4种菌为大肠杆菌、痢疾杆菌、空肠弯曲杆菌和伤寒杆菌。通过基因芯片技术在相同的条件下完成了属于4个菌属的23株肠道菌的杂交检测，并得到了特异性的菌属杂交图谱。研究表明，基因芯片可以准确且灵敏地检测出同一属细菌的相近种，从而达到检测一些致病菌的目的。基因芯片技术从产生到现在仅经历了十多年的时间，但由于具有快速、高效、灵敏、准确、大信息量和高特异性的特点，目前已经运用于生命科学的各个研究领域。它能够在很短的时间内分析大量的生物分子，从而快速、准确地获取样品中的多种信息，使检测效率较传统检测手段有了极大提高。但是目前利用基因芯片检测微生物成本较高，且分析范围较窄、重复性较差，故其应用和推广还有待研究。

3使用益生菌调控肠道发育和健康

直到最近，人们才开始使用低剂量抗生素和针对特定病原体的疫苗来调控食品生产用动物以及家禽消化道的健康。然而，由于消费者的恐惧以及对药物使用新规定的担忧，许多家禽生产商已经减少或停止使用低剂量抗生素，但是随之而来的问题是家禽肠炎发病率升高。益生菌制剂已被用于促进肠道的成熟和预防肠炎的发展。微生物制剂可用作家禽肠道微生物生态系统和宿主生理机能的一种调节剂。动物饲喂益生菌带来的健康好处包括预防肠道感染、降低血清胆固醇水平、表达抗癌活性物、刺激免疫系统、提高乳糖利用率和SCFA含量。初生雏鸡接受细菌治疗可以为其提供促进肠道发育的优先定植菌群。优先定植的菌群可以通过改变宿主糖蛋白和黏蛋白的糖组来影响营养基础，从而调节发育中雏鸡肠道微生物菌群的继承菌种。肠道微生物菌群最重要的功能之一是抑制肠道致病菌的发育。直到最近人们才认识到微生物菌群的抑制作用是因为肠道中细菌间的相互作用从根本上来说是竞争性的。然而，Hofacre等的研究表明，给1日龄雏鸡饲喂竞争性排斥产品，可以在服用该产品后数周内预防疾病的症状。

营养物质的利用率可以通过具有互补性的肠道细菌种间的代谢活动和产生抑制性代谢产物来增强，而营养物质的利用能够产生对病原体定植有抗性的菌群。然而，动物对消化系统疾病和沙门氏菌定植的抵抗力可以通过其在生命的早期接触肠道共生体来增强，肠道共生体能够调控正在发育的肠道的营养基础，并促进能够抑制肠道病原菌生长或毒素生成的肠道微生物菌群的发育。Fukata等指出，用乳桿菌或肠球菌重建肠道菌群的鸡会对产气荚膜梭状芽孢杆菌的定植有更强的抵抗力。这一发现证实了细菌间存在竞争性抑制作用，但Craven等证明益生菌可减少鸡肠道中由产气荚膜梭状芽孢杆菌产生的毒素。这些发现表明益生菌可有效地降低疾病的流行率和严重程度。

结语

在对家畜消化道微生物的研究中，分子生物学分析方法能够避开菌体培养的步骤，实现对菌群的全面分析。不同分析方法各具特点，如高通量测序能对菌体组成和相对丰度进行精确分析，而结合实时荧光定量PCR方法，还可以对不同菌体的具体数量进行确定。此外，还有基于研究消化道中不同菌种组成蛋白差异的质谱分析法，从蛋白质的层面进一步分析家畜消化道中菌群的特性和功能。在实际应用中，实验人员可以根据具体情况选择适宜的检测方法。而最佳的方案是多种分析方法联用，可达到弥补另外一种方法缺点的目的，从而更好地研究家畜消化道的微生物组成。

参考文献

[1] 韩浩月,陈建康,A.A.Pedroso,M.D.Lee.鸡消化道微生物菌群的组成及作用机理(续3)[J].国外畜牧学(猪与禽),2018,38(08):42-44.

[2] 苏少锋,吴青海,其布日,高娃,赵俊利,刘红葵,王蕴华,呼和.家畜消化道菌群的分子生物学研究方法[J].畜牧与饲料科学,2020,41(03):6-10.

[3] 郝凌魁,刘世雄,李冬芳,于春微,李松建,陈灰,高民,胡红莲,刘大程.酵母发酵饲料对瘤胃菌群数量及多样性的影响[J/OL].中国畜牧杂志:1-19[2020-06-30].

[4] 吴凤笋,李文刚.基因芯片技术在动物疫病检测中的应用[J].郑州牧业工程高等专科学校学报,2011,31(02):22-23.

基金项目：内蒙古自治区科技重大专项（ZDZX2016016）；内蒙古自治区科技创新引导奖励资金项目

（2017年度）；内蒙古自治区科技创新引导奖励资金项目（KCBJ2018068）；

第一作者：张彦斌（1983—），男，内蒙古呼和浩特市，微生物检验师（中级），硕士，研究方向为食品质量与安全。[e-mail]

通信作者：张宏博，男，（1986—），内蒙古巴彦淖尔市，工程师，博士，研究方向为食品质量与安全。[e-mail]