HPLC-MS法测定盐酸二甲双胍片中毒性杂质N-亚硝基二甲胺（NDMA）的含量

刘欣 1 和 2 ， 梅勇 1 ，司大龙 1 ， 田建 1 ，田用芳 3 ，周文艳 1 ， 杨莉 1 ， 龙涛 1 ， 郭娟 1 ，粟冲 1

重庆国舒制药有限公司 重庆 401338

重庆国泰康宁制药有限责任公司 重庆 401520

摘要：目的 建立HPLC-MS法检测盐酸二甲双胍片中毒性杂质N-亚硝基二甲胺的含测定方法。方法 以ACE EXCEL3 C18-AR 4.6mm×100mm，3.0μm为色谱柱，流动相为流动相A：0.1%甲酸溶液流动相B：0.1%甲酸甲醇溶液，柱温40℃，检测波长258nm，流速为0.55ml/min，采用APCI+:MRM扫描模式，定量离子对75.0→43.0 m/z。结果：该方专属性强，NDMA在0.985ng/ml～98.5ng/ml范围内浓度与峰面积呈良好线性，线性方程为y =8×10⁴ x–1.88×10⁴，相关系数r为0.9999，该方法的回收率在98.58%～101.45%之间，9份溶液平均回收率为99.9%，RSD为0.9%，准确度良好。结论：该HPLC-MS法能准确检出盐酸二甲双胍片中毒性杂质N-亚硝基二甲胺的含量。

关键词：HPLC-MS法；盐酸二甲双胍片；N-亚硝基二甲胺；含量

盐酸二甲双胍片在临床上主要用于单纯饮食控制不满意的II型糖尿病病人，尤其是肥胖和伴高胰岛素血症者，用本药不但有降血糖作用，还可能有减轻体重和高胰岛素血症的效果^[1]。国外报道盐酸二甲双胍片中检出NDMA杂质。目前所知，NDMA杂质可能通过亚硝化机理生成。即在一定条件下，胺类化合物尤其是仲胺，与亚硝酸钠（NaNO₂）或其他亚硝化试剂反应产生亚硝胺类杂质。盐酸二甲双胍片中NDMA来源分析：（1）原料引入：盐酸二甲双胍合成起始物料分别是二甲胺和双氰胺，原料药二甲胺本身均含有仲胺结果，但整个合成工艺中均未使用或添加亚硝酸钠（NaNO₂）或其他亚硝化试剂（亚硝酰卤化物、亚硝酸酯、三氧化二氮和四氧化二氮），也未使用或添加酰胺类溶剂（如N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等），所以引入亚硝胺类杂质的风险很低。合成过程中引入亚硝酸盐的最大可能性是使用的纯化水。原料药供应商生产所用的纯化水采用双级反渗透膜制备，质量标准中亚硝酸盐符合ChP、EP、USP标准。起始物料双氰胺生产过程中用的工业用水亚硝酸盐的限度为0.001mg/L。由此可知，原料药合成工艺过程中引入亚硝胺类杂质的风险极低。（2）制剂引入：盐酸二甲双胍片生产过程中除原料药外，使用辅料有玉米淀粉、甘露醇、羟丙甲纤维素和硬脂酸镁，均为常规辅料，无亚硝化试剂，辅料和包材生产过程中均未使用亚硝化试剂。辅料生产过程中使用的纯化水质量标准中亚硝酸盐符合ChP、EP、USP标准。制剂生产过程中，除原料药、辅料外，所使用纯化水、工业用水等均控制了亚硝酸盐的残留量，符合ChP、EP、USP等标准。所有设备材质均为惰性材料，不会和物料及成品产生化学反应。片剂常温存放和长期稳定性样品均有检出，但无明显增长，均小于0.01ppm，推测可能辅料中一些成分容易氧化，使辅料中残留活性氧物质，导致二甲双胍降解成二甲胺，二甲胺遇到活性氧化物，首先被氧化产生羟胺，然后羟胺和二甲胺反应，最后再氧化得到NDMA。为了准确检测盐酸二甲双胍片中有害杂质，笔者建立了一套HPLC-MS法，能准确检出盐酸二甲双胍片中有害杂质NDMA的含量，现报道如下：

1 材料

1.1 仪器

HPLC-MS（美国安捷伦公司），分析天平(梅特勒托利多)。

1.2 药品与试剂

盐酸二甲双胍片（批号：359601，规格：0.25g，日新株式会社；批号：180301、180302、180303，规格：0.25g，重庆希尔安药业有限公司）、NDMA对照品购于中国食品药品检定研究院，含量99.7%，甲醇为色谱纯，甲酸为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 1.0 μg/m储备液：准确称取适量NDMA对照品，用甲醇溶解并配制成1.0 μg/mL的储备液；
2.1.2 2.0 ng/mL对照品溶液：吸取适量储备液，用水稀释制成2.0 ng/mL对照品溶液；
2.1.3 1.0 ng/mL灵敏度溶液：吸取适量储备液，用水稀释制成1.0 ng/mL灵敏度溶液；2.1.4 供试品溶液的配制：取本品20片，精密称量，研细，准确称取细粉适量（约相当于盐酸二甲双胍250mg）于25 mL容量瓶中，加入20 mL水，超声处理15分钟，然后定容至刻度，摇匀，取适量溶液于离心管中，6000 rpm/分钟的速度离心5分钟，取上清液作为供试溶液。

2.1.5 空白辅料溶液配制，精密称定空白辅料28mg于25 mL容量瓶中，加入20 mL水，超声处理15分钟，然后定容至刻度，摇匀，取适量溶液于离心管中，6000 rpm/分钟的速度离心5分钟，取上清液作为空白辅料溶液。

2.2 检测条件

2.2.1高效液相色谱条件：色谱柱：ACE EXCEL3 C18-AR 4.6mm×100mm，3.0μm；流速：0.55 mL/min   进样量为10 μL； 柱 温为40 ℃,；流动相A: 0.1%甲酸水、B: 0.1%甲酸甲醇；洗脱程序如下：

时间（分钟）	流动相A(%)	流动相B(%)
0	95	5
3	95	5
5	80	20
5.1	10	90
6	10	90
6.1	95	5
8	95	5

2.2.2质谱条件：

离子源：APCI源，正离子模式；检测方式：多反应监测；雾化气压力：50 psi；气帘气压力：20 psi；NC电流：3μA；离子源温度：500℃；碰撞气CAD：8；定量离子对75.0→43.0 m/z）。

2.3专属性 空白溶剂和空白辅料不干扰NDMA的含量测定，专属性良好。

2.4 系统适用性：1ng/ml的灵敏度溶液S/N为7.6，符合要求；连续进样6针，峰面积RSD为1.2%，均符合规定。

2.5 检测限 NDMA检测限约为0.002ppm（S/N≈3）。

2.6 线性 NDMA在0.985ng/ml～98.5ng/ml范围内浓度与峰面积线性方程为y =8×104 x-1.88×104，相关系数r为0.9999，线性关系良好。

2.7 准确度 各浓度的回收率在98.58%～101.45%之间，9份溶液平均回收率为99.9%，，RSD为0.9%，准确度良好。

2.8 精密度 6份制剂供试品溶液，NDMA检出结果RSD为2.0%，精密度良好。

2.9 稳定性试验 分别于0小时，2小时，4小时，8小时和12小时进测定精密度项下的供试品溶液和对照品溶液，计算各杂质的含量，结果供试品和对照溶液峰面积在12小时内变化的RSD均小于2.0%，表明供试溶液和对照溶液在12小时内稳定。

2.10 NDMA杂质含量测定

取4样品（批号：359601，规格：0.25g，日新株式会社；批号：180301、180302、180303，规格：0.25g，重庆希尔安药业有限公司），按照2.1方法制备供试品溶液和对照品溶液，进样测定，按外标法计算含量，批号：359601（规格：0.25g，日新株式会社）和批号：180301、180302、180303（规格：0.25g，重庆希尔安药业有限公司）批NDMA杂质的含量分别如下：0.003%、0.002%、0.002%、0.002%，测定结果表明各自制品和参比制剂的NDMA杂质水平相当，并且含量水平均很低。

3 讨论

盐酸二甲双胍片在贮藏过程中，其辅料中可能存在氧化物质，会氧化生成NDMA杂质。本文通过建立液质联用方法，其专属性强，线性范围广、准确度高，能准确测出盐酸二甲双胍片中微量的NDMA有害杂质。

4 参考文献

[1] 石亚荣，郑艳.盐酸二甲双胍缓释片治疗2型糖尿病的疗效观察[J]．中国医药指南，2012，10(30)：482-483

[第一作者] 刘欣 执业药师，从事药品质量管理与研发，电话：[phone]，邮箱：[e-mail]，

[通讯作者] 梅 勇 高级工程师、执业药师，从事新药研发工作，电话：[phone]，邮箱：[e-mail]