高效液相色谱法测定抗疲劳类保健食品饮料中牛磺酸含量

陈晓丹

摘要：目的 验证《GB/T 5009.169-2016食品安全国家标准 食品中牛磺酸的测定》第二法 丹磺酰氯柱前衍生法 高效液相色谱法是否适用于测定抗疲劳类保健食品中牛磺酸的含量。方法 采用衍生化的方法，将稀释后的样品以丹磺酰氯作为衍生剂，色谱柱为Kromasil 100-5-C18（4.6×150mm，5 μm），流动相：A为乙酸钠缓冲液，B为乙腈，进行等度洗脱（70+30），流速：0.8ml/min，柱温 30℃，进样量：5μl，在254nm检测波长为254处进行检测。结果 牛磺酸在6.125μg/ml-30.63μg/ml（R2=0.9991，n=8）范围内与峰面积线性关系良好，加样回收率范围为99.6%～103.3%。结论 本方法具有专属性强、灵敏度高、稳定性好、重复性佳，适用于抗疲劳类保健食品饮料中牛磺酸的测定，可作为产品质量控制方法。

关键字：高效液相色谱法 牛磺酸 丹磺酰氯

引言

牛磺酸广泛分布于动物体内，尤其是海洋动物和鸡胚中[1]。牛磺酸是一种含硫的非蛋白质氨基酸，在体内以游离状态存在，不参与蛋白质的合成，是人体的条件必须氨基酸，具有广泛的生理功能，可通过保护细胞、抑制自由基、抗氧化、调解细胞内外钙离子平衡等起到缓解体力疲劳、增强免疫力的作用，在营养食品和功能性食品中有着巨大的开发和应用潜力[2]。目前牛磺酸含量的测定方法主要有分光光度法[3]、气相色谱法[4]、薄层色谱法[5]、氨基酸自动分析仪法[6]、高效液相色谱法[7]等。从操作的便捷性、结果的准确性以及仪器的适用性方面考虑，高效液相色谱法操作简便、专属性强、灵敏度高、重现性好，更好地适用与含牛磺酸的保健食品饮料的测定。选择《GB/T 5009.169-2016食品安全国家标准 食品中牛磺酸的测定》第二法 丹磺酰氯柱前衍生法 高效液相色谱法来测定抗疲劳类保健食品中牛磺酸的含量。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（带有二极管阵列或紫外检测器）、分析天平（感量分别为0.0001 g和0.001 g）、涡旋振荡器、超声波振荡器、pH计（精度0.01）、离心机（不低于5000r/min）、微孔滤膜（0.45μm）。

牛磺酸（CAS号：107-35-7，美国CATO，纯度97.2%） 、丹磺酰氯（5-二甲氨基萘-1-磺酰氯）（色谱纯）、盐酸甲胺（甲胺盐酸盐）、乙酸钠（分析纯）、无水碳酸钠（分析纯）、盐酸（分析纯）、冰乙酸（分析纯）、乙腈（色谱纯）、乙酸锌、亚铁氰化钾、 含牛磺酸的保健食品饮料。

2 方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Kromasil 100-5-C18  （4.6×150mm，5 μm），检测波长为254nm，流动相：A为乙酸钠缓冲液，B为乙腈，进行等度洗脱（70+30），柱温 ：30℃，

进样量：5μl ，流速：0.8ml/min。

2.2溶液制备

①对照品溶液制备：精密称取0.1260g牛磺酸标准品（纯度97.2%），用水溶解并定容至100ml，即得质量浓度为1.225mg/ml牛磺酸储备液。临用时用水稀释成一系列标准溶液，质量浓度为0μg /ml、6.125μg /ml、12.25μg /ml、18.38μg /ml、24.50μg /ml、30.63μg /ml。

②沉淀剂制备：沉淀剂Ⅰ（称取15.0g亚铁氰化钾，用水溶解并定容至100ml），该沉淀剂在室温下3个月内稳定；沉淀剂Ⅱ（称取30.0g乙酸锌，用水溶解并定容至100ml）该沉淀剂在室温下3个月内保持稳定。

③衍生化试剂制备：称取0.424g无水碳酸钠，加40ml水溶解，用1mol/L盐酸溶液调pH值至9.5，用水定容至50ml，即得质量浓度为80nml/L、pH=9.5的碳酸钠缓冲液；称取0.15g丹磺酰氯，用乙腈溶解并定容至100ml，即得质量浓度为1.5mg/ml的丹磺酰氯溶液，临使用前配制。称取2.0g盐酸甲胺，用水溶解并定容至100ml，即得质量浓度为20mg/L的盐酸甲胺溶液。

④供试品溶液制备：精密量取25ml原液至50ml容量瓶中，加水稀释并定容至刻度，即得样品稀释液。精密称取5.000g样液于锥形瓶中，于锥形瓶中加1.0ml沉淀剂Ⅰ，涡旋混合，1.0ml沉淀剂Ⅱ，涡旋混合，转入100ml容量瓶中，用水定容至刻度，充分混匀。样液于5000r/min下离心10min，取上清液备用。

⑤空白溶液：取纯化水作为空白溶液。

⑥试样衍生化：准确吸取1.00ml所得上清液到10ml具塞玻璃瓶试管中，加入1.00ml碳酸钠缓冲液，1.00ml丹磺酰氯溶液，充分混合，室温避光衍生反应2h（1h后需摇晃1次），加入0.10ml盐酸甲胺溶液，涡旋混合，以终止反应，避光静置至沉淀完全。取上清液经0.45um微孔滤膜过滤，

取滤液备用。

2.3方法学验证

2.3.1 空白试验：取“2.2”项下的空白溶液、质量浓度为6.125μg /ml的标准溶液、供试品溶液进行衍生化反应，按“2.1”项下的色谱条件进行分析，结果见图1、2、3从色谱图可以看出，在该色谱条件下，牛磺酸色谱峰没有干扰，分离度良好，峰形对称，响应高，专属性强。

图1  空白溶液衍生物色谱图

图2  标准溶液衍生物色谱图

图3  供试品溶液衍生物色谱图

2.3.2 线性范围：分别精密吸取质量浓度为0μg /ml、6.125μg /ml、12.25μg /ml、18.38μg /ml、24.50μg /ml、30.63μg /ml的标准品溶液，照“2.2”项下试样衍生化过程进行衍生处理，按”2.1“项下色谱条件进行分析，以牛磺酸的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制定标准曲线，结果见图4。得线性回归方程为y=0.2257x-0.0630，R2=0.9991（n=6）。结果表明牛磺酸质量浓度在6.125μg/ml-30.63μg/ml范围内线性良好。

图四 标准曲线

2.3.3重复性试验：准确吸取1.00ml“2.2”项下供试品溶液，照“2.2”项下试样衍生化过程进行衍生处理，按”2.1“项下色谱条件进行分析，结果如表一所示，牛磺酸含量RSD%为0.77，重复性符合《GB/T 27404-2008实验室质量控制规范 食品理化检测》中方法学验证的规定（RSD%≤3.8），方法重复性良好。

表一  功能饮料样品中牛磺酸含量

样品	供试液取样量（g）	供试液含量（g/100g）	原液含量（mg/100g）	平均值（mg/100g）	RSD（%）
平行样1	5.0446	0.0238	47.6	47.8	0.77
平行样2	5.0442	0.0237	47.4
平行样3	5.0446	0.0238	47.6
平行样4	5.0435	0.0240	48.0
平行样5	5.0453	0.0242	48.4
平行样6	5.0582	0.0240	48.0

2.3.4回收率试验：精密称取9份样品的供试液各2.5g，加入含量相当于样品50%、100%、150%的牛磺酸标准品，进行三水平各三平行样品进行加标测试，结果如表二所示。牛磺酸回收率在99.6%～103.3%之间，准确度符合《GB/T 27404-2008实验室质量控制规范 食品理化检测》中附录F方法学验证的要求。（含量在大于100mg/kg时，回收率95%～105%）表明该方法回收率良好，准确度高。

表二功能饮料试样加标测定结果

样品名称	供试液取样量（g）	供试液本底量（mg）	加入储备液体积（ul）	实际加标量（mg）	实测值（mg）	回收率（%）	平均值%	RSD%
1-1	2.5652	0.6131	325	0.3981	1.0235	103.10	101.1	1.52
1-2	2.5708	0.6144	325	0.3981	1.0257	103.32
1-3	2.5682	0.6138	325	0.3981	1.0247	103.22
2-1	2.5744	0.6153	650	0.7962	1.4082	99.59
2-2	2.5844	0.6177	650	0.7962	1.4137	99.97
2-3	2.579	0.6164	650	0.7962	1.4107	99.77
3-1	2.5296	0.6046	950	1.164	1.7707	100.18
3-2	2.5289	0.6044	950	1.164	1.7702	100.16
3-3	2.5304	0.6048	950	1.164	1.7713	100.22

备注：牛磺酸储备液浓度为1.225mg/ml。

3.结论

该方法专属性强、灵敏度高、稳定性好、重复性好，适用于含牛磺酸的功能饮料测定，可作为牛磺酸功能饮料的质量控制方法。

参考文献

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[2]杨雪洁，贺晓云，刘清亮，黄昆仑.牛磺酸缓解疲劳及提高免疫力研究进展[J].中国食物与营养.2021(10):50-54.

[3]杨涓，味智清，庞伟.分光光度法测定宁夏枸杞中牛磺酸含量[J].农业科学研究，2005，（02）；28-30.

[4]耿曙光，袁代解，黄宗武，等.基于气相色谱-质谱的大鼠溃疡性结肠炎模型结肠组织代谢组学特征〔J〕.广东医学，2016，（08）：1113-1117.

[5]索娟，黄晓丹，卢炳万，等.藿胆丸制剂中牛磺酸的薄层扫描含量测定[J].中成药，2007，（02）：313-314.

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[7]陈燕梨，刘莉，牛磺酸滴眼液中牛磺酸含量的测定[J].宜春学院学报，2012（08）；114-116.