玻璃酸钠滴眼液（5ml:5mg）无菌检查的方法适用性试验的研究

王楼妃

【摘要】目的：建立玻璃酸钠滴眼液（5ml：5mg）的无菌检查方法，确保无菌检验结果准确可靠。方法：试验方法采用薄膜过滤法。结果：供试品组的阳性对照、试验组与对照组可在5天内生长良好，供试品组与阴性对照组均无菌生长，说明供试品在该检验量和该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计，上述检查方法可行。结论：通过璃酸钠滴眼液（5ml：5mg）三个批次的薄膜过滤法的验证，试验结果表明该产品按薄膜过滤法进行无菌检查。

【关键词】玻璃酸钠；滴眼液；无菌检查；研究

玻璃酸钠为天然高分子化合物，是构成组织基质的重要成分，具有较好的黏弹性，对角膜具有保护作用；与纤黏连接蛋白结合，促进角膜上皮细胞的连接和伸延，加快角膜创伤愈合。此外，玻璃酸钠分子具有强亲水能力和润滑作用，可稳定泪膜、防止角结膜干燥和减轻眼组织摩擦，缓解干眼症的不适症状。

玻璃酸钠滴眼液伴随下述疾患的角结膜上皮损伤：干燥综合征（Sjögrenʹs syndrome）、斯·约二氏综合征（Stevens-Johnson syndrome）、干眼综合征（dry eye syndrome）等内因性疾患；手术后、药物性、外伤、配戴隐形眼镜等外因性疾患。因此，本研究主要对玻璃酸钠滴眼液无菌检查的方法适用性试验，现作如下汇报：

1.验证程序

1.1仪器：本研究使用仪器共有六个，即（1）HTY-602A型集菌仪；（2）ZSP-S150型生化培养箱；（3）ZSP-M250型霉菌培养箱；（4）SE602F型百分之一电子天平

DHG-9240A电热恒温鼓风烘干箱；（5）BSC-1300-Ⅱ-A2-X型生物安全柜；（6）YXQ-LS-75SII型立式压力蒸汽灭菌器。

1.2培养基：本研究使用培养基共有五种，即（1）胰酪大豆胨液体培养基；（2）硫乙醇酸盐流体培养基；（3）沙氏葡萄糖琼脂培养基；（4）胰酪大豆胨琼脂培养基；（5）PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。

1.3菌种

本试验所用的菌株大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、 白色念珠菌和黑曲霉，均是第3代，来源：中国食品药品检定研究院。

1.4供试品信息

委托样品生产单位：北京汇恩兰德制药有限公司

1.5方法适用性试验步骤

1.5.1菌液的制备：

取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18-24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养2～3天，上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度菌悬液。接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天或直到获得丰富的孢子，加入适量含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液。

菌悬液若在室温下放置，一般应在2小时内使用；若保存在2～8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

1.5.2冲洗液配制

0.5%吐温80的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，分装，灭菌。

1.5.3适用性试验方法：薄膜过滤法。

1.5.3.1供试品组

取一次性全封闭集菌器一套，适量无菌冲洗液润湿滤膜并滤干，取供试品30支，按薄膜过滤法均匀过滤至滤简内，再用无菌冲洗液冲洗，每次冲洗100ml，冲洗次数3次，分别于一个滤筒内加入100ml的硫乙醇酸盐流体培养基，另一个滤筒内加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基，剩余一个滤筒在最后一次冲洗液中加入1ml不大于100Cfu的金黄色葡萄球菌过滤，过滤完成向其中加入100m1的硫乙醇酸盐流体培养基作为阳性对照。

1.5.3.2试验组

取一次性全封闭集菌器一套，适量无菌冲洗液润湿滤膜并滤干，取供试品30支，按薄膜过滤法均匀过滤至滤筒内，再用无菌冲洗液冲洗，每次冲洗100ml，冲洗次数3次，在最后一次冲洗液中，向滤筒内分别加入1ml不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌过滤，过滤完成后向滤筒内加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基。

另取一次性全封闭集菌器一套，同上述方法操作，样品过滤完成向滤筒内分别加入1ml不大于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉过滤，过滤完成后向滤筒内加入100ml胰酪大豆胨液体培养基。

1.5.3.3对照组   不过滤供试品，与1.5.3.2试验组同法进行操作。

1.5.3.4阴性对照组

取一次性全封闭集菌器一套，适量无菌冲洗液润湿滤膜并滤干，以无菌冲洗液代替供试品溶液，同供试品组方法操作。

1.5.3.5 培养

培养温度：硫乙醇酸盐流体培养基置于30～35℃培养，胰酪大豆胨液体培养基置于20～25℃。

培养时间：供试品组的阳性对照、试验组、对照组在规定条件下培养不超过5天，供试品组和阴性对照组在规定温度下培养不少于14天，培养期间应定期观察并记录是否有菌生长。

1.6验证结果

菌种类型	菌落计数 cfu	样品批号	冲洗量 ml	硫乙醇酸盐液体培养基
				试验组	对照组
金黄色葡萄球菌	56	HB220101	300	+	+
		HB220102	300	+	+
		HB220103	300	+	+
大肠埃希菌	62	HB220101	300	+	+
		HB220102	300	+	+
		HB220103	300	+	+
生孢梭菌	59	HB220101	300	+	+
		HB220102	300	+	+
		HB220103	300	+	+
菌种类型	菌落计数 cfu	样品批号	冲洗量 ml	胰酪大豆胨液体培养基
				试验组	对照组
枯草芽孢杆菌	60	HB220101	300	+	+
		HB220102	300	+	+
		HB220103	300	+	+
白色念珠菌	64	HB220101	300	+	+
		HB220102	300	+	+
		HB220103	300	+	+
黑曲霉	42	HB220101	300	+	+
		HB220102	300	+	+
		HB220103	300	+	+

1.7试验结果：按规定温度培养14天，培养期间应定期观察并记录是否有菌生长。

天数

硫乙醇酸盐流体培养基 (30～35ºC)

胰酪大豆胨液体培养基 （20～25℃）

供试品组（批号）

阳性对照（批号）

阴性 对照

供试品组（批号）

阴性 对照

HB22 0101

HB22 0102

HB22 0103

HB22 0101

HB22 0102

HB22 0103

HB22 0101

HB22 0102

HB22 0103

第1天

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第2天

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+

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第3天

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+

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+

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第4天

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第5天

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第6天

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第7天

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第8天

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第9天

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第10天

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第11天

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第12天

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第13天

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第14天

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备注：有微生物生长记为“+”，无微生物生长记为“-”。

【参考文献】

[1]《中国药典》（2020年版）四部 通则1101无菌检查法。