简介:目的研究从人脂肪组织中提取的血管周干细胞(humanperivascularstemcells,hPSCs)的特点,并探讨其成骨、成脂及成软骨分化的能力。方法采用流式荧光细胞分选技术(FACS)在12例行吸脂手术患者的脂肪标本中分选出人基质血管成分(humanstromalvascularfraction,hSVF)和由周皮细胞(CD34^-、CD146^+、CD45^-)与外膜细胞(CD34^+、CD146^-、CD45^-)组成的hPSCs进行培养,比较其克隆增殖能力,然后将2种细胞进行成骨、成脂和成软骨诱导,诱导结束后分别进行茜素红染色、油红O染色和阿尔新蓝染色,并检测成骨诱导后的成骨相关基因mRNA表达。结果hSVF和hPSCs均以纺锤形成纤维样细胞生长,hPSCs呈现出更快的融合趋势,且细胞形态更均一。hPSCs细胞相比于hSVF具有更强的克隆增殖能力(P〈0.05)。hPSCs细胞在成骨及成软骨方向比hSVF具有更强优势,而hSVF在成脂方向比hPSCs具有更强优势。成骨诱导后,hPSCs的成骨基因碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)和骨钙素(osteocalcin,OCN)的相对表达量要明显高于hSVF(P〈0.05)。结论hPSCs细胞具有干细胞的多项分化潜能,且其在成骨方向具有很强优势,可成为骨组织工程学中理想的种子细胞来源。
简介:摘要目的探讨长链非编码RNA (lncRNA)-抗分化非编码RNA(DANCR)对人脂肪来源间充质干细胞(hASCs)成脂、成骨分化能力的影响。方法收集中国医学科学院整形外科医院的3例女性患者腹部脂肪抽吸术后废弃的脂肪组织(年龄25~35岁),分离培养hASCs。构建DANCR敲减与过表达质粒,利用慢病毒感染的方式在hASCs中敲减或过表达DANCR,将实验分为5组:敲减DANCR的实验组(shDANCR1、shDANCR2)、敲减对照组(shScrmble)、过表达DANCR的实验组(pCDH-DANCR)、过表达对照组(pCDH-GFP),每组样本量为3例。RT-PCR检测上述5组细胞中DANCR的表达量。将上述5组慢病毒感染成功后的hASCs进行成脂或成骨诱导,成脂诱导7 d进行油红O染色鉴定成脂效果,成骨诱导14 d进行茜素红染色鉴定成骨效果,并应用RT-PCR检测成脂分化关键转录因子PPAR-γ、C/EBPα、FABP4、Adiponectin和脂类合成酶基因LPL、GPDH、FASN、ACC1和HSL,以及成骨分化关键转录因子RUNX2、OCN、OPN、BMP2及ALP的表达。实验数据均采用均值±标准差表示,2组间数据采用t检验(Student’s t-test)进行比较,P < 0.05为差异具有统计学意义。结果设计的2条shRNA敲减序列均可使hASCs中DANCR的表达显著减少,与对照组比较,DANCR表达量分别下降了86%和74%,差异具有统计学意义( t=84.07、P <0.001,t=75.52、P <0.001)。构建的DANCR过表达质粒可以有效增加hASCs中DANCR表达量,与对照组相比,增加了(15.067±1.986)倍,差异具有统计学意义(t=12.24, P<0.001 )。成脂、成骨诱导实验显示,敲减DANCR会引起hASCs成脂诱导后脂滴数量显著多于对照组,2组敲减组与对照组相比,差异均具有统计学意义(t=17.24、P <0.001,t= 30.68、P <0.001),成脂分化关键转录因子PPAR-γ、C/EBPα、FABP4、Adiponectin以及脂类合成酶的关键基因LPL、GPDH、FASN、ACC1、HSL的表达都显著高于对照组;而过表达DANCR后会抑制脂滴的形成及上述基因的表达。同样在成骨诱导中,敲减DANCR后hASCs成骨诱导14 d钙结节形成量显著多于对照组,差异具有统计学意义(t=15.25、P <0.001,t=24.61,P <0.001),成骨分化关键基因RUNX2、OCN、OPN、BMP2及ALP的表达也显著高于对照组,而过表达DANCR后成骨诱导14 d钙结节形成量较对照组显著减少(t=40.81、P<0.001),成骨分化关键转录因子表达水平也会降低。结论lncRNA-DANCR能够抑制hASCs的成脂、成骨分化,DANCR表达量的变化影响hASCs的成脂、成骨分化效果,可以作为调控hASCs成脂、成骨定向分化的潜在靶点。
简介:目的比较CD204+和CD204-两种人脂肪来源细胞的干细胞特性和体外诱导成软骨的能力。方法分离培养人脂肪来源细胞并进行流式细胞分选.分别获得CD204+和CD204-两种细胞。将这两种细胞培养扩增至第2代,观察其形态学特点:成脂、成骨定向诱导分化,油红O染色、茜素红染色定性;同时将两种细胞进行pellet成软骨诱导分化,比较体外诱导成软骨的能力.并以HE、SafraninO和Ⅱ型胶原免疫组化染色等进行鉴定。结果经流式细胞分选,脂肪来源细胞中CD204表达15日性串约为10%。分选后的CD204+和CD204-细胞均呈成纤维细胞样贴壁生长.但CD204-细胞具有更强的增殖能力。成脂诱导10d后.曲组细胞油红0染色均可见胞浆内有大量红染脂滴,但CD204+细胞具有更强的成脂潜能。成骨诱导2周后.曲组细胞芮素红染色均可见钙结节红染.而CD204-细胞具有更强的成骨潜能。同时,细胞Dellet成软骨诱导4周后,人体观可见CD204细胞组pellet形成白色透明样软骨成分.而CD204+细胞组pellet外观微黄。HE和Ⅱ型胶原免疫组化染色均妊示CD204组pellet可见成熟软骨陷窝形成.Safranin0染色显示CD204-组软骨特异性细胞外基质沉积:而CD204+细胞组peliet则呈纤维化改变。结论脂肪组织来源的CD204-细胞具有干细胞的生物学特点.且有良好的成软骨潜能,可以成为软骨组织工程良好的种子细胞来源。
简介:目的探讨带有绿色荧光蛋白基因的重组杆状病毒修饰后的小鼠羊水干细胞(nlouseamnioticfluidstemcells,mAFSs)是否仍保持成骨分化潜能。方法体外原代培养小鼠羊水干细胞,并进行成脂成骨诱导分化,鉴定多向分化潜能;体外构建并扩增重组杆状病毒(Baculovirus—CMV—GFP,By—GFP);By—GFP体外转导小鼠羊水干细胞,流式细胞仪检测其转导效率;经Bv—GFP基因修饰后的小鼠羊水干细胞进行成骨诱导分化。结果小鼠羊水干细胞体外具有良好的增殖能力,3代后的细胞呈现较均一的梭形、漩涡状生长,且小鼠羊水干细胞体外具有成脂成骨分化潜能。体外成功构建重组杆状病毒,经Sf9细胞扩增后,极度稀释法测定其滴度可达10^9v.g/ml;Bv—GFP体外可较有效转导小鼠羊水干细胞,其转导效率为52.85%,且经Bv—GFP基因修饰后的小鼠羊水干细胞仍保持成骨分化潜能。结论小鼠羊水来源干细胞是一种理想的干细胞,杆状病毒是一种新型病毒基因载体,体外能较有效转导小鼠羊水干细胞且不改变其成骨分化潜能。经重组杆状病毒基因修饰的羊水干细胞会为今后的骨组织工程提供一种新的治疗模式。
简介:间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)的来源非常广泛。由于不同组织来源的影响,MSC之间都会存在一定的差异。本研究分析比较脐带、脂肪及骨髓组织来源的MSC的基本生物学特性。从脐带、脂肪和骨髓分离培养MSC,在显微镜下观察这3种来源的MSC的形态(UC—MSC,AD—MSC和BM—MSC),用流式细胞术诱导分化试验及定量荧光PCR分别检测UC-MSC,AD-MSC和BM-MSC的免疫表型、分化能力和过氧化物酶增殖激活受体-γ(peroxisomeproliferator—activatedreceptor-1,PPAR-1)mRNA的表达水平。结果表明,UC-MSC、AD-MSC和BM—MSC的形态都是成纤维细胞样;经罗丹明和DAPI染色后,用共聚焦显微镜观察发现它们的细胞形态类似;这三种来源Msc的免疫表型符合Msc的鉴定标准,而且表达水平一致;这三种来源MSC的成骨分化潜能相似,而成脂分化潜能存在较明显的差异,其中AD—MSC成脂能力最强,BM-MSC次之,UC-MSC最差。检测脂肪形成早期起重要作用的过氧化物酶增殖激活受体-γ(PPAR-1)mRNA表达水平在三种来源MSC中的基础表达水平,发现PPAR-γmRNA在AD-MSC中最高,在BM—MSC次之,而在UC—MSC中最低,与成脂能力的表现相一致。这表明三种来源MSC成脂能力存在差异可能与它们PPAR-1的基础表达水平有关。结论:UC—MSC,AD—MSC和BM—MSC的形态类似;免疫表型符合MSC鉴定标准,表达水平一致;成骨分化能力相似,而成脂分化能力不同;PPAR-γmRNA表达水平不一。关于差异的相关机制有待进一步研究。