简介:摘要目的探究微小RNA(miR)-373-3p对胶质母细胞瘤细胞自噬和舒尼替尼敏感性的影响及其机制。方法体外常规培养U251细胞,采用50 μmol/L舒尼替尼作用72 h构建耐舒尼替尼U251细胞株。(1)采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测U251、耐舒尼替尼U251细胞miR-373-3p的表达。将耐舒尼替尼U251细胞分为空白对照组、无义序列组、miR-373-3p模拟物组,后2组细胞分别转染miR-373-3p无义序列、miR-373-3p模拟物,采用RT-qPCR检测细胞miR-373-3p的表达。将细胞分为U251组、耐舒尼替尼U251组、无义序列+耐舒尼替尼U251组、miR-373-3p模拟物+耐舒尼替尼U251组,转染后采用CCK-8法检测细胞活性,TUNEL染色检测细胞凋亡率,免疫荧光染色检测细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达,Western blotting检测细胞凋亡、自噬相关蛋白的表达。(2)构建pGL3-自噬相关基因7(ATG7)野生型(WT)和pGL3-ATG7突变型(MUT)质粒,双荧光素酶报告分析系统检测miR-373-3p模拟物组、无义序列组细胞荧光素酶活性。将细胞分为U251组、耐舒尼替尼U251组、无义序列+耐舒尼替尼U251组、miR-373-3p模拟物+耐舒尼替尼U251组,转染后采用RT-qPCR、Western blotting分别检测细胞ATG7 mRNA和蛋白的表达。(3)将耐舒尼替尼U251细胞分为空白对照组、ATG7阴性对照组、ATG7过表达组,转染后采用RT-qPCR、Western blotting分别检测细胞ATG7 mRNA和蛋白的表达。将U251细胞、耐舒尼替尼U251细胞分为U251组、耐舒尼替尼U251组、无义序列+耐舒尼替尼U251组、miR-373-3p模拟物+耐舒尼替尼U251组、miR-373-3p模拟物+ATG7阴性对照+耐舒尼替尼U251组、miR-373-3p模拟物+ATG7过表达+耐舒尼替尼U251组,转染后采用CCK-8法检测细胞活性,TUNEL染色检测细胞凋亡率,Western blotting检测细胞凋亡和自噬相关蛋白的表达。结果(1)与U251细胞比较,耐舒尼替尼U251细胞miR-373-3p的表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组、无义序列组比较,miR-373-3p模拟物组细胞miR-373-3p的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与U251组比较,耐舒尼替尼U251组细胞活性增加,凋亡率下降,B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白的表达升高,Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白的表达和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase 3)/Caspase 3值降低,Beclin 1蛋白的表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值增加,p62蛋白的表达减少。与无义序列+耐舒尼替尼U251组比较,miR-373-3p模拟物+耐舒尼替尼U251组细胞活性降低、凋亡率提高,Bcl-2蛋白的表达降低,Bax蛋白的表达和活化Caspase 3/Caspase 3值升高,Beclin 1蛋白的表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值降低,p62蛋白的表达增加,差异均有统计学意义(P<0.05);与U251组比较,耐舒尼替尼U251组LC3荧光颗粒增多且荧光亮度升高;与无义序列+耐舒尼替尼U251组比较,miR-373-3p模拟物+耐舒尼替尼U251组细胞荧光颗粒减少且亮度减弱。(2)对于pGL3-ATG7 WT质粒,miR-373-3p模拟物组荧光素酶活性低于无义序列组,差异有统计学意义(P<0.05)。与U251组比较,耐舒尼替尼U251组ATG7 mRNA和蛋白的表达增加;与无义序列+耐舒尼替尼U251组比较,miR-373-3p模拟物+耐舒尼替尼U251组ATG7 mRNA和蛋白的表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)与空白对照组、ATG7阴性对照组比较,ATG7过表达组细胞ATG7 mRNA和蛋白的表达均增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。与无义序列+耐舒尼替尼U251组比较,miR-373-3p模拟物+耐舒尼替尼U251组细胞活性降低、凋亡率较高,Bcl-2蛋白的表达降低,活化Caspase 3/Caspase 3值、Bax蛋白的表达升高,Beclin 1蛋白的表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值降低,p62蛋白的表达升高;与miR-373-3p模拟物+ATG7阴性对照+耐舒尼替尼U251组比较,miR-373-3p模拟物+ATG7过表达+耐舒尼替尼U251组细胞活性增加,凋亡率降低,Bcl-2蛋白的表达升高,活化Caspase 3/Caspase 3值、Bax蛋白的表达降低,Beclin 1蛋白的表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值升高,p62蛋白的表达减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论miR-373-3p通过调控自噬而增强胶质母细胞瘤细胞舒尼替尼敏感性,其机制可能与靶向ATG7有关。
简介:摘要目的初步探究自噬核心蛋白Atg101对白色脂肪细胞衰老的影响。方法构建Atg101敲减的3T3-L1成熟脂肪细胞模型,验证Atg101对自噬相关蛋白LC3和p62蛋白的影响。构建并分析人类皮下脂肪组织的RNA-seq数据库,基于Atg101与其他基因FPKM值的Pearson相关系数(R2>0.4, P<0.050)预测共表达基因集并进行KEGG和Reactome富集分析。构建年轻小鼠(8周龄)和老龄小鼠(18个月龄)模型,实时定量PCR(RT-qPCR)和Western印迹法检测Atg101在腹股沟皮下脂肪和内脏脂肪中的表达水平。进一步通过RNA-seq、Western印迹和RT-qPCR检测白色脂肪细胞衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)、细胞周期及线粒体稳态相关基因的表达差异,分析Atg101敲减对脂肪细胞衰老的影响。结果在3T3-L1脂肪细胞敲减Atg101后自噬相关蛋白LC3-Ⅱ显著降低,p62蛋白明显上调,提示细胞自噬受损。KEGG富集分析发现Atg101共表达基因集主要富集于自噬和衰老相关通路;Reactome富集分析发现该基因集与多个细胞周期信号通路相关。RT-qPCR和Western印迹证实Atg101在老龄小鼠皮下脂肪组织中mRNA和蛋白表达水平均下调,内脏脂肪组织蛋白水平也显著降低。最后,白色脂肪细胞模型中Atg101敲减后SASP相关基因表达上调,细胞周期特异性基因表达受限并且细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子p16、p21表达显著增高,线粒体稳态调节基因表达也受到抑制。结论Atg101可能通过影响自噬活动调控白色脂肪细胞衰老,从而破坏线粒体稳态。
简介:目的探讨微小RNA-20a(miR-20a)对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭和增殖的影响及可能机制。方法采用Lipofectamine2000脂质体法将miR-20a抑制剂和阴性对照载体分别转染SiHa细胞株。采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测两组细胞中miR-20a的表达以验证转染效果,细胞迁移实验、Transwell细胞侵袭实验及MTT法分别检测miR-20a的表达抑制对SiHa细胞迁移、侵袭和增殖的影响;荧光素酶报告实验及Westernblotting验证miR-20a对下游预测靶基因自噬相关蛋白7(ATG7)的调控作用。结果QPCR检测结果显示,与阴性对照组比较,miR-20a抑制剂组SiHa细胞中miR-20a的表达量显著降低(P〈0.01),证明转染模型构建成功。细胞迁移实验显示,转染48h后,阴性对照组细胞的划痕愈合率为(75.68±5.94)%,高于抑制剂组的(38.24±7.68)%(P〈0.01)。Transwell细胞侵袭实验显示,转染48h后,阴性对照组穿膜细胞数为(96.35±10.23)个,多于抑制剂组的(23.54±7.26)个(P〈0.01)。MTT法检测显示,阴性对照组和抑制剂组细胞增殖能力的差异无统计学意义(P〉0.05)。与阴性对照组相比,转染miR-20a模拟物+ATG7野生型3’UTR报告基因载体的细胞荧光素酶活性显著下降(P〈0.01),而转染miR-20a模拟物+ATG7突变型3’UTR报告基因载体的细胞荧光素酶活性无显著变化(P〉0.05);Westernblotting检测显示,与阴性对照组比较,抑制剂组细胞ATG7蛋白表达量显著增加(P〈0.01)。结论降低miR-20a的表达能显著抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力,但细胞增殖能力不受影响,这可能与miR-20a直接作用于其下游靶基因ATG7并调控其表达紧密相关。
简介:摘要目的探讨hsa_circ_0006948(circ_0006948)对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法120例骨肉瘤组织和40例癌旁正常组织标本来源于2009—2015年就诊于商丘市第一人民医院的骨肉瘤患者。采用微阵列分析筛选骨肉瘤细胞Saos-2中差异表达的circRNA,实时荧光定量聚合酶链反应检测骨肉瘤细胞Saos-2和正常成骨细胞NHOst、骨肉瘤组织及癌旁组织中circ_0006948、miR-490-3p和自噬相关蛋白7(ATG7)mRNA的表达水平,细胞克隆形成实验检测细胞的增殖能力,Transwell实验检测细胞的侵袭能力,细胞划痕实验检测细胞的迁移能力,双荧光素酶报告基因实验检测circ_0006948与miR-490-3p、miR-490-3p与ATG7之间的相互作用,TargetScan数据库分析miR-490-3p与ATG7的相关性,Western blot法检测细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果Saos-2细胞中circ_0006948、miR-490-3p和ATG7 mRNA的表达水平与NHOst细胞差异均有统计学意义(均P<0.01),骨肉瘤组织及癌旁正常组织中circ_0006948、miR-490-3p和ATG7 mRNA的表达水平差异均有统计学意义(均P<0.01)。circ_0006948-siRNA组细胞的克隆数目、迁移数目和迁移率分别为(32.78±1.76)个、(37.58±1.82)个和(36.93±1.45)%,均低于siRNA NC组[分别为(65.72±1.45)个、(78.63±1.93)个和(65.32±1.74)%,均P<0.01]。miR-490-3p mimics组细胞的克隆数目、迁移数目和迁移率分别为(20.08±1.54)个、(30.24±1.78)个和(21.15±1.68)%,均低于mimics NC组[分别为(60.36±1.83)个、(76.93±1.64)个和(40.56±1.27)%,均P<0.01]。miR-490-3p inhibitor+siRNA NC组细胞的克隆数目、迁移数目和迁移率分别为(90.34±1.72)个、(120.89±2.34)个和(70.83±1.93)%,均高于inhibitor NC+siRNA NC组[分别为(61.27±1.73)个、(75.82±1.82)个和(42.38±1.74)%,均P<0.01]。circ_0006948 siRNA+miR-490-3p inhibitor组细胞的克隆数、迁移数和迁移率分别为(58.74±1.98)个、(73.46±1.04)个和(40.35±1.72)%,均低于miR-490-3p inhibitor+siRNA NC组[分别为(90.34±1.72)个、(120.89±2.34)个和(70.83±1.93)%,均P<0.01]。ATG7-siRNA组细胞的克隆数目、迁移数目和迁移率分别为(20.56±1.87)个、(40.36±1.76)个和(20.96±1.73)%,均低于siRNA NC组[分别为(65.46±1.74)个、(90.87±2.32)个和(40.87±2.03)%,均P<0.01]。miR-490-3p mimics+pcDNA-ATG7组细胞的吸光度值为0.54±0.11,高于miR-490-3p mimics组(0.36±0.08, P<0.05);miR-490-3p mimics组细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达水平与mimics NC组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。miR-490-3p mimics+pcDNA-ATG7组细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达水平与miR-490-3p mimics组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论circ_0006948通过miR-490-3p调控ATG7蛋白的表达,从而调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。
简介:摘要目的探讨hsa_circ_0006948(circ_0006948)对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法120例骨肉瘤组织和40例癌旁正常组织标本来源于2009—2015年就诊于商丘市第一人民医院的骨肉瘤患者。采用微阵列分析筛选骨肉瘤细胞Saos-2中差异表达的circRNA,实时荧光定量聚合酶链反应检测骨肉瘤细胞Saos-2和正常成骨细胞NHOst、骨肉瘤组织及癌旁组织中circ_0006948、miR-490-3p和自噬相关蛋白7(ATG7)mRNA的表达水平,细胞克隆形成实验检测细胞的增殖能力,Transwell实验检测细胞的侵袭能力,细胞划痕实验检测细胞的迁移能力,双荧光素酶报告基因实验检测circ_0006948与miR-490-3p、miR-490-3p与ATG7之间的相互作用,TargetScan数据库分析miR-490-3p与ATG7的相关性,Western blot法检测细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果Saos-2细胞中circ_0006948、miR-490-3p和ATG7 mRNA的表达水平与NHOst细胞差异均有统计学意义(均P<0.01),骨肉瘤组织及癌旁正常组织中circ_0006948、miR-490-3p和ATG7 mRNA的表达水平差异均有统计学意义(均P<0.01)。circ_0006948-siRNA组细胞的克隆数目、迁移数目和迁移率分别为(32.78±1.76)个、(37.58±1.82)个和(36.93±1.45)%,均低于siRNA NC组[分别为(65.72±1.45)个、(78.63±1.93)个和(65.32±1.74)%,均P<0.01]。miR-490-3p mimics组细胞的克隆数目、迁移数目和迁移率分别为(20.08±1.54)个、(30.24±1.78)个和(21.15±1.68)%,均低于mimics NC组[分别为(60.36±1.83)个、(76.93±1.64)个和(40.56±1.27)%,均P<0.01]。miR-490-3p inhibitor+siRNA NC组细胞的克隆数目、迁移数目和迁移率分别为(90.34±1.72)个、(120.89±2.34)个和(70.83±1.93)%,均高于inhibitor NC+siRNA NC组[分别为(61.27±1.73)个、(75.82±1.82)个和(42.38±1.74)%,均P<0.01]。circ_0006948 siRNA+miR-490-3p inhibitor组细胞的克隆数、迁移数和迁移率分别为(58.74±1.98)个、(73.46±1.04)个和(40.35±1.72)%,均低于miR-490-3p inhibitor+siRNA NC组[分别为(90.34±1.72)个、(120.89±2.34)个和(70.83±1.93)%,均P<0.01]。ATG7-siRNA组细胞的克隆数目、迁移数目和迁移率分别为(20.56±1.87)个、(40.36±1.76)个和(20.96±1.73)%,均低于siRNA NC组[分别为(65.46±1.74)个、(90.87±2.32)个和(40.87±2.03)%,均P<0.01]。miR-490-3p mimics+pcDNA-ATG7组细胞的吸光度值为0.54±0.11,高于miR-490-3p mimics组(0.36±0.08, P<0.05);miR-490-3p mimics组细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达水平与mimics NC组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。miR-490-3p mimics+pcDNA-ATG7组细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达水平与miR-490-3p mimics组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论circ_0006948通过miR-490-3p调控ATG7蛋白的表达,从而调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。
简介:摘要目的分析毒死蜱对大鼠海马神经元自噬相关蛋白表达的影响,探讨自噬在急性毒死蜱中毒中枢神经损伤中的作用。方法于2018年10月,将35只雄性清洁级SD大鼠根据观察时间点随机分成7组,即0.5 d、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d组和对照组,每组5只。各观察组采用81.5 mg/kg毒死蜱一次性灌胃处理,对照组给予橄榄油灌胃。连续观察大鼠一般情况和中毒症状,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测海马组织中自噬相关蛋白Beclin1、P62/SQSTM1、LC3的表达,免疫组织化学染色观察脑组织细胞形态和LC3表达。结果Western blot结果显示,与对照组比较,1 d、2 d、3 d组大鼠海马神经元Beclin1蛋白表达升高,0.5 d、1 d、2 d组P62/SQSTM1蛋白表达降低,2 d组大鼠海马神经元LC3蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学结果显示,5 d组大鼠海马神经元排列紊乱,部分细胞核轮廓消失,7 d组尤其明显,LC3蛋白呈胞质表达,表达量逐渐增高,第2天达高峰。结论急性毒死蜱中毒大鼠自噬的早期激活可能参与了毒死蜱诱导的海马神经元损伤。
简介:摘要目的观察I型糖尿病肾病大鼠模型肾脏中自噻相关蛋白LC3、p62的表达情况。方法①建立STZ诱导的I型DN大鼠模型将20只雄性SD大鼠随机分为正常对照组和糖尿病肾病模型组。采用鼠尾静脉注射STZ的方法诱发SD大鼠糖尿病肾病(STZ为50mg/kg)。对照组注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液,3天后开始测定血糖和尿糖值,当血糖值≥16.7mmol/L,尿糖值为3+-4+者可确定为糖尿病模型。成模后第八周处死大鼠,留部分肾皮质组织,4%多聚甲醛固定。②进行HE染色观察两组间肾组织病理改变。③免疫组织化学检测两组间肾组织LC3和P62蛋白表达及分布情况。④采用Pearson相关分析评判LC3、p62与STZ大鼠蛋白尿、肌酐的相关性。结果①STZ诱导的I型DN大鼠的血尿生化检测结果血糖波动在19.2-23.3mmol/l;血肌酐波动在72.5-122.7umol/l;尿蛋白波动在4.63-9.19g/24h②STZ大鼠模型基本病理改变与正常对照组相比,可见肾小球体积明显增大,肾小管局灶性萎缩,小管间质造型纤维化,基底膜增厚,系膜细胞及系膜基质增多。③p63、LC3免疫组化结果肾组织小管上皮中,p62表达明显增加,LC3表达明显下降,定量分析结果显示,STZ大鼠肾组织小管中,p62较正常组增加2.5倍,LC3下降35%(p<0.01)
简介:摘要目的探究骨科切口感染者创面病原菌分布,并分析骨科切口感染者自噬相关蛋白微管结合轻链蛋白-3(LC-3)、自噬特异性基因-1(Beclin-1)和泛素结合蛋白(P62)表达水平。方法选择2014年5月至2017年8月于西安市第九医院治疗的276例骨科患者为研究对象,将40例正处于切口感染期患者作为观察组,分析其创面病原菌分布;另采用随机数字表法选取暴露表皮、暴露皮下组织及暴露肌肉骨骼中未感染36例患者纳入对照组,分析两组患者感染切口创面组织标本Beclin-1、LC-3和P62自噬相关蛋白表达水平。结果276例骨科患者中治疗后发生切口感染者40例,感染率为14.49%。40例切口感染者共检出病原菌67株,包括革兰阴性菌46株(68.66%),其中铜绿假单胞菌为18株,占比最高(26.87%),其次为大肠埃希菌11株(16.42%);革兰阳性菌19株(28.36%),凝固酶阴性葡萄球菌8株(11.94%),其次为金黄色葡萄球菌7株(10.45%);酵母样真菌2株(2.99%)。感染切口创面组织标本免疫组织化学结果显示,观察组患者LC-3和Beclin-1蛋白阳性表达率显著低于对照组,差异有统计学意义(χ2 = 7.488、P = 0.006,χ2 = 11.800、P = 0.001);P62蛋白阳性表达率显著高于对照组,差异有统计学意义(χ2 = 13.511、P < 0.001)。Western blot结果显示观察组患者LC-3和Beclin-1灰度值显著低于对照组,P62灰度值显著高于对照组,差异均有统计学意义(t = 15.282、4.207、8.678,P均< 0.001)。结论骨科切口感染者创面病原菌以革兰阴性菌的铜绿假单胞菌和大肠埃希菌为主,自噬相关蛋白LC-3、Beclin-1降低,P62升高,自噬水平降低,推测骨科切口感染与自噬相关蛋白表达存在密切相关性。