简介:目的获得猪胰岛素启动子调控外源基因的高效表达载体,为制备转基因猪胰岛特异性表达目的基因奠定基础。方法利用猪胰岛素启动子(PIP,包含5'调控区、第一外显子、第一内含子及第二外显子ATG前的序列共1.5kb)构建表达载体,连接PIP和EGFP的酶切位点HindⅢ设计在起始密码子前,命名为PIP-HindIIIEGFP。鉴于酶切位点的插入位置可能会影响外源基因的表达效率,对载体进行了优化:将HindIII酶切位点删除,实现PIP和EGFP无缝连接,载体命名PIP-EGFP;将第一内含子3'端的内含子剪接受体位点(splicingacceptorsite,SA)突变为HindIII内切酶识别位点,命名为PIP-SA(M)-EGFP。三种载体分别电转染小鼠胰岛素瘤β细胞株MIN-6细胞、猪耳成纤维细胞以及猪肾细胞,48h后通过荧光强度、流式分析、RT-PCR及Westernblot检测,验证载体的表达效率。结果转染细胞后,三种载体都仅在MIN-6胰岛β细胞表达绿色荧光。RT-PCR及其产物测序结果显示三种载体的胰岛素启动子第一内含子的剪切存在差异:载体PIP-HindIII-EGFP和PIP-EGFP的内含子存在剪切和不剪切两种情况,剪切不稳定;载体PIP-SA(M)-EGFP的SA位点突变后内含子不剪切,流式细胞及Westernblot检测显示,与另外两种载体相比,该载体目的蛋白的表达量最高。结论通过突变胰岛素启动子第一内含子的3'端的剪接受体位点,成功获得了胰岛β细胞的高效表达载体,可用于制备胰岛特异表达外源基因的转基因猪。
简介:目的观察黄芪多糖(APS)对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、细胞因子及顺铂(DDP)所致免疫功能低下的影响。方法90只小鼠,设空白对照组10只,余80只依次造模为荷瘤小鼠,并随机分为8组:模型组(等体积生理盐水),顺铂阳性对照组(6mg/kgDDP),APS低(50mg/kg)、中(100mg/kg)、高剂量(200mg/kg)组,联合用药低、中、高剂量组(DDP剂量减半,APS各剂量同上),于造模次日起各组分别腹腔注射等体积的药物0.3mL。DDP每周一次,其余药物每天1次,连续20d。于第21天取血清采用ELISA法测定细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平,并观察各组抑瘤率及免疫器官指数。结果DDP、APS低、中、高剂量及联合用药低、中、高剂量组对小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑瘤率分别为49.30%、17.21%、39.68%、42.98%、51.02%、57.21%、65.11%(与模型组比较P〈0.05或0.01;联合用药组与DDP组比较P〈0.05)。与空白对照组比较,APS中、高剂量组和联合用药组脾脏指数显著升高;与模型组比较,APS高剂量和联合高剂量脾脏指数差异有显著性(P〈0.05);与DDP组比较,APS各剂量和联合用药组小鼠胸腺指数和脾脏指数均升高。结论APS能提高Lewis肺癌小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平;增强DDP所致免疫功能低下小鼠的免疫功能,对免疫器官有一定的保护作用;能抑制小鼠Lewis肺癌细胞的生长,在与DDP减半量联合使用时可使DDP抑瘤作用增强,且其机制可能与增强机体的免疫功能有关,说明APS对DDP有一定的增效减毒作用。此项研究在实体瘤的治疗中有潜在的应用前景。
简介:目的:探讨固本抑瘤Ⅲ号方以及与吉西他滨联合治疗人胰腺癌裸鼠异位移植瘤的抑瘤作用。方法将40只荷瘤裸鼠随机分为对照组、吉西他滨组、固本抑瘤Ⅲ号联合吉西他滨组、固本抑瘤Ⅲ号组,每组10只。于接种后第8天开始给药,观察指标为瘤重、裸鼠体重、移植瘤体积。结果吉西他滨组、固本抑瘤Ⅲ号联合吉西他滨组、固本抑瘤Ⅲ号组的抑瘤率分别为49.2%、68.9%和28.0%。固本抑瘤Ⅲ号联合吉西他滨组较吉西他滨组抑瘤作用更强(P<0.05)。吉西他滨组、固本抑瘤Ⅲ号联合吉西他滨组、固本抑瘤Ⅲ号组移植瘤体积均较对照组明显降低,差异有显著性。固本抑瘤Ⅲ号联合吉西他滨组体重下降明显,体重较对照组、吉西他滨组及固本抑瘤Ⅲ号组明显下降,差异有显著性。结论固本抑瘤Ⅲ号方具有增加吉西他滨化疗治疗人胰腺癌裸鼠腋下移植瘤疗效的作用。