简介:橡胶树起源热带雨林,对低温敏感。在中国橡胶树(Heveabrasiliensis)种植受到严重的低温胁迫影响,而CBF/DREB1(C-repeatbindingfactor/dehydrationresponsiveelementbindingfactor1)是低温信号通路中重要的转录因子,但目前橡胶树中仅克隆到HbCBF1。本研究从橡胶树中克隆出两个新的CBF家族基因HbCBF2和HbCBF3。经测序,HbCBF2和HbCBF3分别编码了234个和242个氨基酸。氨基酸序列分析表明HbCBF2和HbCBF3均含有CBF家族特有两个短肽序列包括一个保守的DNA结合结构域和NLS簇。通过构建进化树发现HbCBF2、HbCBF3与HbCBF1以及拟南芥中的CBF序列同源性很高。将HbCBF2和HbCBF3构建到pGEX4T-1原核表达载体上,在Transetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE电泳检测它们蛋白质表达量为51.8kD和53kD,与预期一致。对蛋白的诱导条件进行优化,构建融合表达质粒pGEX4T-1-CBF2和pGEX4T-1-CBF3,在28℃、IPTG浓度为0.4mmol/L的情况下表达量最佳。实验为纯化蛋白和研究HbCBF2和HbCBF3在橡胶树中的功能提供理论帮助。
简介:启动子是调控外源基因在植物体内表达的“开关”。随着植物转基因技术的广泛应用,无论是基础研究还是应用研究,人们希望能够充分利用启动子来准确控制外源基因在植物体内的表达,使目的基因的“开”和“关”、表达的“多”和“少”、在“何地”和“何时”表达等。能够听从人的指挥,以实现植物育种的分子设计。因此,快速分离和鉴定植物体内各种特异启动子已经成为植物基因工程研究的热点和难点。本文在互补末端连接反向PCR(CELI—PCR)技术基础上建立起…种快速分离目的基因全长cDNA和启动子序列的新方法。该方法利用CELI—PCR进行染色体连续步移,获取足够长的目的基因及其上游基因组DNA序列,再根据转录起始位点是目的基因转录本和启动子的分界点,其下游转录本中的外显于可通过RT-PCR扩增,而上游启动子序列则不能被RT-PCR扩增这一特点,借助RT-PCR进行cDNA连续步移,直到获得全长cDNA,确定启动子基因5’非翻译区的位置,进而精确定位转录起始位点。从而获取目的基因准确的启动子序列和全长cDNA序列。因此,建立在CELI,PCR基础上的RITIS技术,可绕过繁琐的构建cDNA库和5'-RACE等方法快速分离目的基因全长cDNA和启动子序列。