黄连不同炮制品中3种生物碱含量的高效液相色谱法测定

作者：宋平顺，卫玉玲， 赵建邦， 丁永辉

【摘要】 目的建立同时测定黄连不同炮制品中3种生物碱的高效液相色谱分析方法，提高黄连炮制品质量标准。 方法采用色谱柱为大连依利特Kromasil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-0.1%磷酸(45∶55)（每100 ml含十二烷基黄酸钠0.1 g）为流动相；检测波长为265 nm；流速1.0 ml/min；柱温为室温。结果盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱进样量在0.300～2.700 μg，0.101 6～0.355 6 μg，0.033 1～0.331 2 μg范围呈良好的线性关系。平均回收率为分别为104.01％，101.23％和102.41％，RSD分别为1.45％，1.76％和2.01％。结论该方法准确，灵敏度高，重复性好，适用于黄连炮制品的质量控制。

【关键词】 黄连； 炮制品； 生物碱； 高效液相色谱法

黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.，三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎［1］。上述3种商品分别习称“味连”“雅连”“云连”，主产于四川、湖北、云南、甘肃等地。关于黄连质量控制，《中国药典》采用薄层扫描法测定原药材小檗碱含量［1］ 。文献已有高效液相色测定的报道［2］ 。中医临床应用黄连的炮制规格较多，有关质量研究报道较少［3］ 。为了掌握黄连不同炮制品的规格与质量，为进一步研究和制定炮制品的质量标准奠定基础，本文采用灵敏度高、重复性好的高效液相色谱方法，建立同时测定黄连炮制品中3种生物碱含量的方法。

1 仪器与试剂

美国Waters 515 泵，2487紫外检测器，2420二级管阵裂检测器，717自动进样器。

乙腈为色谱纯；其它试剂均为分析纯；水为娃哈哈水。盐酸小檗碱(110713-200208)、盐酸巴马丁汀(0732-20005)和盐酸药根碱(0733-20005)对照品，由中国药品生物制品鉴定所提供。

20份黄连样品由甘肃省中医学院等单位按《中国药典》附录中药炮制通则加工，样品由作者鉴定为黄连Coptis chinensis。

2 方法与结果

2.1 色谱分析条件 大连依利特Kromasil C18柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm)；乙腈-0.1%磷酸(45∶55)（每100 ml含十二烷基黄酸钠0.1 g）为流动相；检测波长为265 nm；流速1.0 ml/min；柱温为室温；理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于4 000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥12 h的盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱对照品适量，加甲醇制成每毫升含300，50.8和16.56 μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取黄连炮制品粉末(过3号筛)约0.1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入1%盐酸甲醇50 ml，称定重量，超声提取50 min，放冷，再称定重量，用1%盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.4 线性关系的考察 精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液（300 μg/ml）1，3，5，7和9 μl；盐酸巴马汀对照品溶液（50.8 μg/ml）2，4 ，5，6和7 μl；盐酸药根碱对照品溶液（16.56 μg/ml）2，3 ，10，15和20 μl，依次注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，进样量(X)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程,分别为：

盐酸小檗碱：Y =4.550 0X -1.959 7，r=0.999 6

盐酸巴马汀：Y=4.001 1X -1.441 2，r=0.999 3

盐酸药根碱：Y=3.962 2X -1.642 2，r=0.999 9

结果表明盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱进样量在0.300～2.700 μg，0.101 6～0.355 6μg，0.033 1～0.331 2 μg范围呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验 取同一批黄连药材粉末, 按“2.3”项方法制备，精密吸取10 μl，注入高效液相色谱仪，重复进样5次，分别测量盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱的含量，结果RSD分别为0.95％，1.10％，1.74％。

2.6 重复性实验 取同一批黄连药材粉末5份，按“2.3”项方法制备，精密吸取10 μl，注入高效液相色谱仪，测定盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱的含量，平均含量分别为6.416 0﹪，1.697 6％和0.098 5％，RSD分别为1.37％，1.76％和2.56％(n=5)。结果表明此法重复性良好。

2.7 稳定性实验 取同一批黄连药材粉末, 按“2.3”项方法制备，于配制后0，2，4，6和8 h进样，精密吸取10 μl, 注入高效液相色谱仪，测定盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱含量，样品溶液在8 h内基本稳定，RSD分别为1.61％，1.48％和2.04％。

2.8 加样回收率实验 取已知盐酸小檗碱（含量为6.416 0％）、盐酸巴马汀（含量为1.697 6％）和盐酸药根碱（含量为0.098 5％）的黄连药材粉末0.05 g，精密称定，精密加入盐酸小檗碱（0.208 6 mg/ml）、盐酸巴马汀（0.208 6 mg/ml）和盐酸药根碱（0.208 6 mg/ml）lml，按供试品溶液的制备方法操作，测定其含量，并计算回收率。结果分别为104.01％，101.23％和102.41％，RSD分别为1.45％，1.76％和2.01％。

2.9 样品测定 对所收集的20份样品按“2.3”项方法制备，精密吸取对照品与样品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，计算含量。结果见表1。 表1 20批黄连炮制品中3种生物碱的含量测定

3 讨论

3.1 提取方法的考察本实验比较了甲醇、1%盐酸甲醇和流动相为溶剂，采用超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30，40 和50 min ，测定同批样品，结果表明以1%盐酸甲醇为溶剂提取略高于甲醇，与流动相提取相当，选择1%盐酸甲醇超声处理40 min为提取条件。

3.2 耐用性实验不同流动相比较，采用乙腈-0.05 mol/L磷酸氢二钠(35∶65)（磷酸调pH=3.0）、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠(43∶57)（每1 000 ml含十二烷基黄酸钠1.7 g），其分离效果没有本实验采用的流动相好。检测波长选择，应用二级管阵裂检测器进行吸收光谱扫描，3种生物碱均有4个最大吸收峰，其中265 nm和348 nm处吸收与样品相同，可进行含量测定，经比较265 nm和348 nm处，对3种生物碱含量没有明显的影响，由于是单一药材无干扰，均可选择做为含量测定。不同色谱柱比较，考察了Kromasil C18、GraceSmartRP18 ，结果相当，当柱效差时，有拖尾现象，特别是盐酸药根碱峰分离不好。

黄连经过萸炙、酒炙和姜炙后中所含盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药的含量或增加或降低，可能是炮制浸润时间、温度等掌握不同造成的差异，因此优化工艺具体参数显得尤为重要。测定结果表明，按《中国药典》方法炮制，3种黄连炮制品盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱含量在一个稳定相近的范围内，可以选择3种生物碱作为黄连炮制品质量控制的手段之一，以3种生物碱的总量评价黄连炮制品的质量更为合理。

【参考文献】
［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：213.

［2］ 晁若冰，张 浩，庄燕黎，等.高效液相色谱法测定黄连药材中小檗碱型生物碱的含量［J］.药物分析杂志，2003，23（5）：354.

［3］ 修彦风，徐德生，冯 怡，等.不同用量的吴茱萸炮制黄连后成分的比较［J］.中草药，2003，34（4）：20．