黄芪 HPLC-ELSD含量测定提取方法分析研究

危菊芬 赵忠庆 杨文云 刘云斌

【摘要】 目的 采用A，B，C三种提取方法提取黄芪中黄芪甲苷，通过比较方法A,B,C的提取纯化时间、溶剂用量及含量检出，筛选出一种简单、有效的黄芪药材含量测定的提取方法,并通过HPLC-ELSD对黄芪甲苷含量测定分析方法进行线性范围、回收率、稳定性等验证，确保此方法准确可靠。方法 采用3种不同的前处理方法A,B,C制备药材供试品溶液，利用HPLC-ELSD测定黄芪药材供试品溶液中黄芪甲苷的含量，色谱柱为Capcell Core C18 (4.6mm×150mm,2.7μm)；流动相为乙腈—水(32:68)；柱温：29.99℃；流速：1.0mL/min；蒸发光检测器(ELSD)，雾化温度：110℃，蒸发温度：40℃；气体流速：1.40SLM。结果 通过3种方法的提取时间、溶剂用量和含量综合比较，方法B均优于方法A和方法C，且黄芪甲苷的进样量在0.32675-1.30700μg范围内线性关系良好(R2=0.999)，平均回收率为95.92%，RSD=1.23%，在48h内稳定性较好，RSD=0.0876%。结论 方法B对样品提取简单，加样回收率高，稳定性好，结果准确可靠，可作为黄芪药材中黄芪甲苷含量测定方法。

【关键词】 黄芪药材；HPLC-ELSD；含量测定；提取方法

1 仪器及试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(安捷伦公司，配有四元梯度泵、自动进样器、柱温箱)和蒸发检测器（Agilent Technologies 380-ELST）；超声波清洗器；电热恒温水浴锅；电子天平（赛多利斯，Sartorius BSA 224S-CW）；中药粉碎机; D101大孔吸附树脂柱（柱内径1.5cm,长12cm）。

1.2 试药

1.2.1 对照品 黄芪甲苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110781-200613）。

1.2.2实验样品 黄芪（云南白药集团购进）。

1.2.3试剂 甲醇（Merk公司，色谱纯）、乙腈（Merk公司，色谱纯）、超纯水、正丁醇（分析纯）、氨水（分析纯）。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Capcell Core C18 (4.6mm×150mm,2.7μm)；流动相:乙腈—水（32:68）；柱温29.99℃；流速:1.000mL/min；蒸发光检测器（ELSD）,雾化温度：110℃，蒸发温度：40℃，气体流速：1.40SLM。

2.2对照品溶液的制备

2.2.1 阴性对照溶液：甲醇。

2.2.2 对照品储备液制备

2.2.2.1储备液①制备 精密称定黄芪甲苷对照品13.07mg置10mL容量瓶内，加甲醇稀释至刻度制成1mL含1.307mg的溶液，即得。

2.2.2.2储备液②制备 精密称定黄芪甲苷对照品54.40mg置10mL容量瓶内，加甲醇稀释至刻度制成每1mL含5.44mg的溶液，即得。

2.3供试品溶液制备 将黄芪粉碎成中粉备用。

2.3.1 方法A（《中华人民共和国药典》2015年版 一部）：取本品中粉约4 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 mL使溶解，放冷，通过D101大孔吸附树脂柱(内径1.5 cm，长12 cm)，以水50 mL洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继续用70％乙醇80 mL洗脱，收集洗液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。[1]

2.3.2 方法B：取本品中粉约4 g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇60 mL超声30min，静置5min，倾出上清液；残渣再加甲醇50mL超声30min，静置5min，倾出上清液；残渣再加甲醇40mL超声30min，静置5min,倾出上清液，合并三次上清液，浓缩至干，残渣加水10mL，微热溶解，转移至分液漏斗，用水饱和正丁醇萃取4次，每次50 mL，合并正丁醇液，氨试液洗2次，每次50mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得。[2]

2.3.3 方法C：取本品中粉约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液5 mL，振摇使充分润湿，再加入正丁醇50 mL，密塞，超声处理(功率600 W，33 kHz)15 min，静置分层，倾出上层正丁醇液，下层再加入正丁醇50mL，同法再处理1次，合并2次正丁醇液，滤过，滤液用水洗涤2次，每次30 mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并定容为5 mL，即得。[3]

2.4 HPLC-ELSD测定

2.4.1 取储备液②1mL置10mL容量瓶内，加甲醇稀释置刻度，制成每1mL含0.544mg的溶液，即得。

2.4.2按方法A、B、C且每种方法处理4次，制备得到12个供试品溶液，即得。

2.4.3精密吸取对照品溶液5μL和10μ和12个供试品溶液每个5μL注入液相色谱仪进行色谱分析。

2.4.4 方法A、B、C的黄芪甲苷含量、提取纯化时间、所用溶剂量见表1。

表1 黄芪提取纯化方法比较

处理方法 处理时间(h) 溶剂用量（mL） 黄芪甲苷平均含量
A B C	24 4 3	460 450 155	0.0788% 0.1188% 0.0375%

2.4.5 结论 通过A、B、C三种方法对黄芪药材进行提取纯化测定分析研究，方法B的溶剂用量和处理时间均少于方法A，且黄芪药材中黄芪甲苷的平均含量较高。

黄芪甲苷

图1 方法B供试品色谱图

2.5 线性范围的考察

2.5.1 精密量取黄芪对照品储备液①0.5、0.8、1.1、1.4、1.7、2.0mL分别置6个10mL容量瓶内，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成0.06535，0.10456，0.14377，0.18298，0.22219，0.26140mg/mL的线性溶液，分别精密吸取线性溶液5μL注入液相色谱仪测定，即得。

2.5.2 结果 如图2

图2 线性回归两点对数方程图

2.5.3 结论 黄芪甲苷进样量在0.32675-1.30700μg线性关系良好，回归线方程为Y=1.146x+2.642,R²=0.999，相关系数较好。

2.6 精密度试验

2.6.1 精密量取储备溶液①1.1mL置10mL容量瓶内，用甲醇稀释至刻度，制成每1mL含0.14377mg的溶液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，分别精密吸取精密度试验溶液5μL注入液相色谱仪且重复进样6次进行色谱分析。

2.6.2 结果 重复进样6次，平均峰面积为300.25104，RSD为1.10%。

2.6.3 结论 表明仪器精密度较好，所测定的数据准确可靠性。

2.7 加样回收率试验

2.7.1 精密量取对照品储备液①0.4，0.5，0.6mL分别置三个具塞锥形瓶内，置水浴锅上蒸干，相当于在三个锥形瓶内分别依次加入了0.5228，0.6535，0.7842mg对照品，然后分别精密称量约2g黄芪药材粉末置3个具塞锥形瓶内，采用方法B对3个样品进行前处理，即得。

2.7.2 分别精密吸取5μL进行色谱分析，平均回收率为95.92%，RSD为1.23%（回收率的计算公式为：(M3-M1)/M2×100%），如表2。

表2 加样回收率试验结果

序号	样含量(M1)/mg	对加量(M2)/mg	检测量(M3)/mg	回收率/% (M3-M1)/ M2×100%	平均回收率/%	RSD /%
B1 1.1097 0.5228 1.6043 94.61 B2 1.1145 0.6535 1.7477 96.89 95.92 1.23 B3 1.1188 0.7842 1.8736 96.25

2.7.3 结论 表明方法B准确度较高，可作为黄芪药材中黄芪甲苷含量测定提取纯化方法。

2.8 稳定性试验

2.8.1取储备液②1mL置10mL容量瓶内，加甲醇稀释置刻度，制成每1mL含0.544mg的溶液，即得。

2.8.2 取黄芪药材粉末4g，精密称定，按方法B处理，即得。

2.8.3 分别精密吸取已放置0、6、12、24、36、48h的供试品溶液5μL注入液相色谱仪进行色谱分析。

2.8.4 结果 平均含量为0.0625%，RSD为0.0876%.

2.8.5 结论 表明方法B处理的样品溶液在48h内很稳定。

3 讨论

3.1 方法A、B、C在处理时间上分别为24,4,3h，溶剂用量为460,450,155mL；平均含量一次为0.0788%，0.1188%，0.0375%；说明方法B对黄芪药材中黄芪甲苷提取纯化效率高，所测含量较高，与药典方法A比较，处理步骤相对减少，处理时间明显缩短；表明方法B的提取纯化较A和C较好。

3.2通过线性范围考察，回归方程Y=1.146X+2.642,R²=0.999,表明黄芪甲苷进样量在0.32675-1.30700μg范围时，对数含量与对数峰面积呈良好的线性关系；通过精密度试验，RSD为1.10%，表明HPLC-ELSD稳定性、重现性较好。

3.3 方法A中采用大孔吸附树脂过滤除杂，方法B前处理方法不采用大孔吸附树脂，B法色谱峰也未受到杂质峰的影响且含量检出提高。

3.4 方法B通过加样回收率分析研究，平均回收率为95.92%，RSD为1.23%，表明回收率良好，使用方法B提取完全；通过稳定性试验考察，48h所测得黄芪甲苷峰面积的RSD为0.0876%，表明方法B处理的供试品溶液在48h内稳定性好。所以方法B可用作黄芪药材黄芪甲苷含量测定的提取纯化方法。

3.5 有文献^[5]研究过采用不同的提取溶剂（水、甲醇、正丁醇）进行考察，水和正丁醇提取效果差，而用甲醇提取完全，所以本文采用甲醇作为提取溶剂。方法B经过三次的超声处理后，使用甲醇150mL，让黄芪中的黄芪甲苷提取更加完全 。

参考文献

[1]国家药典委员会.《中华人民共和国药典》2015年版,(一部) [S]北京，国家药典委员会编，中国医药科技出版社，2015.6。

[2] 丁如贤，李霞，李一珺，孙雪妹，杨明华.黄芪药材、饮片中黄芪甲苷含量测定方法的改进[J].2013,8(6)；669-671

[3]陈有根，辛敏通，杨滨，郭洪祝.黄芪药材中黄芪甲苷含量测定方法的改进[J].中国新药杂志，2008,17(21)；1857-1859

[4] 潘细贵，汪洋，雷湘，等.大孔吸附树脂纯化黄茂总皂昔的提取工艺研究[J].中国医院药学杂志，2005，25(11)：1029—1030

[5]刘浩文，刘嘉仪，杨妙荣，陈建萍，王冬梅.黄芪药材中黄芪甲苷含量测定两种方法的比较研究[J].中药新药与临床药理，2011，22(6)：659-662

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