蛋壳膜的微结构及用作皮肤修复敷料的研究

汤天翊1,彭晓慧2

2，暨南大学生物医学工程系,510632，广州

摘要：稀盐酸处理鸡蛋壳得到蛋壳膜，采用扫描电镜观察发现它是由上下纤维薄层包裹中间纤维堆砌后层组成的三层结构。3T3成纤维细胞能在膜面增殖，生长情况良好；利用蛋壳膜修复小鼠皮肤创伤，大体观察在三周内伤口愈合，组织学分析表明伤口组织结构完整，完成了修复。研究表明蛋壳膜可作为创伤修复或护创敷料，有一定的应用前景。

关键词：蛋壳膜，敷料，纤维膜，皮肤修复

1.前言

蛋壳膜是指鸡蛋壳和蛋清之间的那层薄膜，不溶于水，90%的组分为蛋白质，溶菌酶、氨基酸含量高、透气性好，有消炎、杀菌作用，是一种天然的“生物敷料”1。临床报道在治疗褥疮2，皮肤烫伤3、化脓性创面4、外伤性鼓膜穿孔以及用“药物鸡蛋膜”敷盖法治疗皮肤缺损中取得了较好的效果。蛋壳膜微观结构如何，是否因能促进细胞在膜面增殖5，以便加速上皮形成，从而作为敷料促进皮肤外伤的修复？因此本研究使用蛋壳膜作为支架材料诱导细胞生长，从而探讨进行深度创伤皮肤再生修复的可能性6。

2.实验方法

制取蛋壳膜。采用5%（v/v，分析纯）盐酸酸溶法,经1天更换1次新鲜酸液，4天反复换液，除去硬壳的无机质，保留有机活性成分。经蒸馏水反复洗涤，直至pH值为中性，得到蛋壳膜7。

蛋壳膜60℃真空干燥后取蛋壳膜表面和断面样品，粘附在载物台上喷金后在扫描电子显微镜（15kV,ESEMXL-30,Philips-FEI,荷兰）下观察蛋壳膜表面和断面结构。

小鼠3T3成纤维细胞培养与接种。取200万3T3复苏后在培养液（DEME高糖培养基+10%胎牛血清+1%双抗）中培养12-14天，每2天换液一次，待细胞铺满培养瓶后，用胰蛋白酶消化，离心除去胰酶，计数得到约1200万个种子细胞，加0.5毫升培养液制成细胞悬液。裁剪蛋壳膜5片大小为5mm*5mm，经高压蒸汽灭菌后备用。将细胞接种在蛋壳膜上，每片50万个细胞。培养一定时间后在倒置显微镜(eclipseTE300，Nikon,Japan)下观察细胞形态。

取昆明小鼠6只，造直径为2cm的圆形全皮缺损伤口，分别设置空白组2只和实验组4只。实验组敷接种小鼠3T3成纤维细胞的蛋壳膜，3周后大体观察创伤修复情况。

3.结果与讨论

（1）蛋壳膜的结构

稀盐酸溶解蛋壳的无机质后，得到白色蛋壳膜，膜面光滑。图一为蛋壳膜表面与断面在扫描电镜下的结构图。从图中可知：膜厚度约为60-70微米，为中间纤维堆积层被上下两薄层膜覆盖。有意思的是上下两薄层致密，这种结构防止水渗透进纤维堆积层，长期浸泡在水中不发生溶胀而破坏膜的稳定性。蛋壳膜化学结构中90%由蛋白质构成，还包括脂肪和少量碳水化合物；其中蛋白中还含有一定量的蛋白多糖。该膜经多次处理强度仍然较高，足以在后续的细胞培养和动物试验中进行有效操作。

（2）蛋壳膜面细胞的增殖

蛋壳膜因为强度高，不溶于水，且较薄，可以采用高压灭菌，70%酒精浸泡，以及γ-射线辐照等方法灭菌。我们采用高压灭菌和酒精浸泡的方法得到无菌蛋壳膜，形状保持完好。

将小鼠3T3成纤维细胞扩增后，经12-14天的增殖，细胞在培养瓶可铺满整个培养瓶；再经胰蛋白酶消化，细胞部分悬浮脱离培养瓶底部，经过计数得到约1200万个细胞，离心浓缩成细胞悬液，将细胞悬液滴到消毒后的蛋壳膜上，按每片的蛋壳膜种植50万个细胞。两周后经显微镜观察膜表面的细胞生长情况（图2）。培养时间3，6，9，12后发现随时间的延长，膜表面细胞越来越多，表明细胞在蛋壳膜表面不断增殖，也证明蛋壳膜表面适合细胞生长。

（3）蛋壳膜作为敷料用于创伤修复

蛋壳膜经消毒处理后备用。选取昆明白鼠若干只，空白对照为不用蛋壳膜组，实验组选取种植细胞蛋壳膜组，实验三周后发现加蛋壳膜组小鼠伤口基本愈合，而对照组伤口面积还有40%没有修复（图3）。这表明有蛋壳膜的参与，负载种子细胞后受损的组织修复速度加快，完整性提高。但修复的到底是不是真正的皮肤组织还需要进一步的切片分析。

4.结论

蛋壳膜为多层结构，能很好促进细胞在其表面生长、增殖；利用蛋壳膜更好地促进了皮肤创伤再生修复。

主要参考文献

1，安艳茹，夏梦颖，黄玉萍，周叶方.鸡蛋壳膜的开发利用.食品工业科技，2013（3）：375-378+382

2，徐玉凤.新鲜鸡蛋壳内膜外用治疗早期褥疮的疗效观察.江西医药，2004(6):453.

3，王馨苓,李丽平,王尚云,王振荣鸡蛋壳内膜治疗II-III度烫伤.现代中西医结合杂志，2001（12）：1179

4，孙瑞章.蛋壳膜应用于化脓性创面.内蒙古医学杂志，1989（2）：51

5，赵红斌，张西正，李瑞欣，解宏伟，陈旭义.骨髓间充质干细胞在鸡蛋膜为支架材料上复合培养的实验研究.生物医学工程与临床，2006（4）：206-209

6，高广明.蛋膜敷盖代人工植皮治疗大面积皮损.临床医药实践，2009（12）：259-260

7，史贤鼎.盐酸浓度对制作蛋壳膜的影响.生物学教学，2005（9）：47-48