不同浓度脂多糖对哮喘大鼠气道炎症、气道重塑及TLR4表达的影响刘梅

刘梅

关键词：脂多糖；气道炎症；气道重塑

哮喘的病理改变的两大特征为气道炎症和气道重塑。气道炎症是哮喘的本质，气道重塑可导致气流不可逆性阻塞和持续的气道高反应，是哮喘重要的病理生理基础，TLR4在哮喘发病中发挥重要作用[1]。我们实验将通过建立哮喘大鼠模型，从整体动物水平研究不同浓度脂多糖对哮喘大鼠气道炎症，气道重塑及TLR4表达水平的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

实验动物SPF级SD大鼠（雄性，体重200±30g)由长沙医学院动物实验中心提供。

1.1.2实验试剂

卵清白蛋白（OVA)、氢氧化铝凝胶为上海生物研究所产品；灭活百日咳杆菌为北京生物研究所提供；水合氯醛由我院附属医院提供；超纯脂多糖(LPS)为美国Sigma公司产品；PCR引物、内参照3肌动蛋白0-actin)引物均由上海生物工程有限公司合成；Trizol试剂、TaqDNA聚合酶、dNTPs、逆转录酶(M-MLV)、oligo(DT)均为北京启明工程有限公司公司产品；凝胶琼脂糖为大连宝生公司产品；

1.1.3实验仪器

402AI型超声波雾化器为江苏鱼跃医疗设备有限公司产品；动物解剖器械为上海医疗器械公司产品；40cmX30cmX20cm有机玻璃箱（自制）；微量移液器为美国ThermoForma公司产品；低温高速离心机为美国Beckman公司产品；紫外分光光度仪为美国Biochrom公司产品;PCR仪为美国MJResearch公司产品;BG-subMINI电泳仪为美国BayGene公司产品;GBOXHR凝胶成像系统为美国SynGene公司产品；-20°C低温冰箱为长虹电器股份有限公司产品；-80°C超低温冰箱为美国ThermoForma公司产品；

1.2研究方法

1.2.1分组情况

将12只SD大鼠按随机原则分成2组，每组6只。①哮喘8周组于致敏后第15天开始给予2%OVA磷酸盐缓冲液（OVAPBS）50ml雾化吸入激发哮喘，每天一次，每次30分钟，持续8周。②空白对照8周组：空白对照组以磷酸盐缓冲液（PBS）代替致敏原注射和雾化吸入8周。哮喘大鼠最后一次激发后24小时内，腹腔注射10%水合氯醛溶液（8ml/kg）麻醉大鼠，无菌摘取全肺，解剖显微镜下分离出哮喘大鼠第3-4级支气管，剥离支气管平滑肌周围的肺动脉、肺静脉、神经纤维、结缔组织等，去除内腔的上皮组织，将支气管平滑肌剪成1mm×1mm×1mm大小的组织块后，将组织转入含有下列成分（胶原酶2mg/ml，木瓜酶3mg/ml，牛血清白蛋白2mg/ml）的D-Hank’s液中，在37℃5%二氧化碳培养箱中消化40-50分钟，用100目不锈钢网过滤，800rpm离心后，去上清，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液悬浮所分离的单细胞，种于25ml培养瓶中，置于370℃5%二氧化碳培养箱中培养。待原代细胞生长融合后，用0.25%胰蛋白酶消化传代，用含10%胎牛血清的DMEM培养液传代培养。实验选用4-10代哮喘大鼠ASMCs，胰酶消化大鼠ASMCs,用台盼蓝染色计数,细胞存活率大于95%。用含10%FBS的DMEM-F12培养基培养24h后，换无血清DMEM-F12继续培养24h,使细狍同步于GO期。胰酶消化细胞，按1X106/ml密度接种于6孔板，换用含10%FBS的DMEM-F12培养基,随机分为5组进行药物干预：（1)空白对照组（A):不作任何干预；（2)低浓度LPS组（B):加入低浓度LPS(终浓度为0.1ng/ml)刺激；（3)高浓度LPS组（C):加V高浓度LPS(终浓度为100ng/ml)刺激；(4)低浓度LPS+TLR4抗体组（D):TLR4抗体（终浓度为50ng/ml)预处理30min后，加入低浓度IPS(终浓度为0.1.ng/ml);(5)高浓度LPS+TLR4抗体组(E)：TLR4抗体（终浓度为50ng/ml)预处理30min后，加入高浓度LPS(终浓度为100ng/ml)。培养24h后收集细胞上清液，离心后待用做RT-PCR

2.2方法

2.2.1将12只健康雄性SD大鼠随机分为4组，每组3只。

正常对照组以生理盐水代替致敏原注射和雾化吸入。哮喘组(A组每日雾化吸入2%OVA/PBS激发哮喘1次，每次雾化30分钟，共8周；低浓度LPS组(B组):致敏阶段每隔2天腹腔注射1ml含0.1ygE.coliLPS，激发阶段每日雾化吸入2%OVA/PBS激发哮喘前1小时腹腔注射1ml含0.1HgE.coliLPS，每次雾化30分钟，共八周;高浓度LPS组(C组)：致敏阶段每隔2天腹腔注射1ml含10ugE.coliLPS，激发阶段每日雾化吸入2%OVA/PBS激发哮喘前1小时腹腔注射1ml含10ugE.coliLPS,每次雾化30分钟，共八周;正常对照组(D组每日雾化吸入生理盐水，每次雾化30分钟，共8

2.2.2组织标本制备

A、B、C、D四组大鼠分别检测气道阻力后，迅速开腹经腹主动脉放血，开胸剥离右肺，置于无菌冰块上分离大鼠气道平滑肌，立即放于液氮中保存，之后放于-80°C冻存，用于RT-PCR测定；左肺则经主支气管内灌注4%多聚甲醛6ml固定，置于4%多聚甲醛中保存，24h后做石蜡包埋，切片（4um左右厚度)，常规HE染色。

2.2.2.1HE染色

(1)HE染色：苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining，HE),简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

(2)操作步骤：①脱蜡：二甲苯20min—二甲苯20min；②脱水：100%酒精3min—95%酒精3min—75%酒精2min—蒸馏水洗3min；③苏木素染色：苏木素液中5min—自来水冲洗一盐酸酒精分化10s—自来水冲洗，显微镜下观察，核着蓝色理想即可；

④伊红复染：伊红液中2min;⑤脱水:95%酒精2min—95%酒精(2min—100%酒精2min—100%酒精GI)2min；⑥透明：二甲苯(含30%石炭酸）3min—甲苯3min—二甲苯3min；⑦中性树胶封片；⑧显微镜下观察。

2.2.2.2气道壁嗜酸性粒细胞（EOS)计数

石蜡切片作常规HE染色后,在同一张切片中选择结构较完整的支气管壁，由同一观察者随机观察并计数5个高倍视野(X400)下支气管壁中浸润的EOS数，并计算其平均数。

2.2.2.3支气管壁厚度图像分析

取实验组及正常对照组的常规HE染色切片，观察及测量大鼠左肺3-4级完整支气管厚度：采用图像分析软件，测定管腔内周长(Pi)，支气管壁面积(WAt)，支气管平滑肌面积(WAm),支气管平滑肌细胞核数(N)，将测得值用管腔内周长(Pi)进行标准化，分别以WAm/Pi，WAm/Pi,N/Pi表示，以了解支气管壁厚度(WAt/pi)、支气管壁平滑肌厚度(WAm/pi)、支气管壁平滑肌细胞核数量(N/pi)。

2.2.3大鼠气道阻力测定

(1)原理:所谓气道阻力就是指气道内单位流量所产生的压力差。给与组胺行支气管激发试验;以动物呼吸机测定呼气相气道阻力。

(2)仪器连接：于最后1次激发后24h内腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉，固定，暴露气管，在环状软骨上方行V型切口，插管（连接三通管)，一侧连接小动物呼吸机，潮气量10ml/kg，频率60次/min。气管插管的另一侧孔接压力传感器，记录气管内压力。

(3)支气管激发剂配制将盐酸组胺的磷酸缓冲液(PBS)配置成1.28mg/ml溶液，然后双倍稀释至0.01mg/ml的溶液，配成倍比稀释的系列浓度组胺作为支气管激发剂。

(4)操作：首先将PBS经连接于雾化器的气管插管雾化吸入大鼠气管内，记录气管内压(AirwayPressure,Paw),此为基础值，然后将支气管激发剂倍比稀释的组胺从低浓度开始雾化吸入，lmin开始测压。若Paw升高不到PBS对照的20°。间隔1Omin喷入下一浓度，直到Paw上升至基础值的20%为止。此时，所需雾化吸入组胺浓度即为PC20的值，PC20值高说明气道的反应性低，即气道阻力低；PC20值低说明气道的反应性高，即气道阻力高。

2.2.4RT-PCR检测大鼠气道平滑肌TLR4mRNA的表达水平

(1)器材准备

实验所用Tip头、EP管用双蒸水配制的0.1%DEPC水中浸泡过夜，烤箱烘干，121°C高压灭菌30min，将灭菌后的Tip头、EP管再次放入烤箱中烘干，备用。

(2)大鼠ASM总RJNA的提取

①从-80°C超低温冰箱中取大鼠ASM1OOmg，放入己预冷的研钵中，加入液氮研磨，在研磨过程中不断加入液氮，以保证组织始终置于液氮中，待组织研磨成粉末状后收集放入装有1.0mlTrizol裂解液的EP管中，用力快速混匀，室温静置5min;

②以下步骤同第一部分。

2.2.5统计学分析

实验结果采用均数土标准差（表示，运用SPSS22.0分析软件进行统计学分析，各组间的比较采用方差分析，两两比较采用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.3结果

2.3.1大鼠哮喘症状表现

实验组大鼠在雾化过程中出现不同程度的喘息、咳嗽、躁动或静伏不动、弓背，严重者呼吸困难、大小便失禁等典型的哮喘发作症状，此为哮喘模型建立成功。正常对照组则无哮喘表现。

2.3.2HE染色及显微镜观察

HE染色观察：哮喘组（A组）可见支气管、肺泡及肺间质充斥大量炎症细胞，支气管壁增厚、粘膜层肿胀充血、皱折增多，平滑肌增厚，管腔狭窄。低浓度LPS组（B组）上述炎症改变未见减轻。高浓度LPS组（C组）上述现象明显减轻。正常对照组（D组）肺组织结构正常，无明显炎症表现。结果见图5-8。

2.3.3气道壁EOS计数

实验结果显示，与正常对照组（D组）相比，哮喘组（A组）、低浓度LPS组(B组)及高浓度LPS组(C组)气道壁EOS计数均显著增加(P<0.01);与哮喘组（A组）相比，低浓度LPS组（B组）气道壁EOS计数显著增加(P<0.05),高浓度LPS组（C组）气道壁EOS计数显著降低(P<0.05);与低浓度LPS组（B组）相比，高浓度LPS组（C组）气道壁EOS计数均显著降低(P<0.01)。见表1。

表1四组气道壁EOS计算对比

2.3.4支气管壁厚度图像分析

实验结果显示，与正常对照组（D组）相比，哮喘组（A组）、低浓度LPS组（B组）及高浓度LPS组（C组）支气管壁厚度(WAt/pi)、支气管壁平滑肌厚度(WAm/pi)、支气管壁平滑肌细胞核数量(N/pi)均显著增加(P<0.01)；与哮喘组（A组）相比，低浓度LPS组（B组）支气管壁厚度(WAt/pi)、支气管壁平滑肌厚度(WAm/pi)、支气管壁平滑肌细胞核数量(N/pi)显著增加(P<0.01),高浓度LPS组（C组）支气管壁厚度(WAt/pi)、支气管壁平滑肌厚度(WAm/pi)、支气管壁平滑肌细胞核数量(N/pi)显著降低(P<0.01)；与低浓度LPS组（B组）相比，高浓度LPS组（C组）支气管壁厚度(WAt/pi)、支气管壁平滑肌厚度(WAm/pi)、支气管壁平滑肌细胞核数量(N/pi)均显著降低(P<0.01)。见表2。

表2四组的WAt/Pi、WAm/PiandN/Pi对比(i±5,n=30)

2.3.5大鼠气道阻力的比较

比较各组大鼠气道反应性发现：与正常对照组（D组）相比，哮喘组(A组）、低浓度LPS组（B组)、高浓度LPS组（C组）气道阻力均显著升高（P<0.01);与哮喘组（A组）比较，高浓度LPS组（C组）气道阻力显著降低（P<0.01)，而低浓度LPS组（B组）差异无统计学意义（P>0.05);而与低浓度LPS组（B组）相比，高浓度LPS组（C组）气道阻力显著降低(P<0.01)o结果见表3。

表3四组气道阻力的对比(x土s,n=6)

2.3.6RT-PCR检测TLR4mRNA在大鼠ASM中表达水平

与D组相比，A、B、C组气道平滑肌TLR4mRNA表达水平显著升高(P<0.01)；与A组相比，B组、C组气道平滑肌TLR4mRNA表达水平显著升高（P<0.01);与B组相比，C组气道平滑肌TLR4mRNA表达水平显著升高（P<0.05)。结果见表4。

表4TLR4mRNA在大鼠ASM中表达水平对比(x±5,n=6)

2.4讨论

我们知道，感染是引发哮喘发作的重要原因，但卫生假说却认为在生命早期接触一定量的病原微生物可降低日后发生哮喘的儿率，究竟细菌感染对于哮喘发生是抑制还是促进，我们从动物实验入手，本部分实验我们参考CamaterosP[2]等建立被动致敏慢性哮喘模型，研究不同浓度LPS刺激对哮喘大鼠气道炎症、气道重塑及TLR4表达的影响。慢性气道炎症与气道重塑是哮喘的重要特征，是哮喘发病过程中两个平行且相互影响的因素，与气道平滑肌的功能状况密切相关[2-3]。哮喘长期的气道炎症反应使气道增生/肥厚，收缩狭窄，粘液分泌增加，出现不同程度的气道重塑，使哮喘加重。气道平滑肌层增厚是哮喘气道重塑的一个重要方面，气道平滑肌可通过合成炎症介质、细胞外基质、细胞黏附分子及其他共刺激分子，推动气道重建[4]。

气道炎症是哮喘发病的本质，多种炎症细胞的浸润促使炎症反应发生。EOS是哮喘发病机制中主要的效应细胞，EOS释放损伤性介质，与哮喘气道炎症有关[5]。实验中我们研究不同浓度LPS刺激对哮喘大鼠气道炎症的改变,通过HE染色观察肺组织病理改变、气道壁EOS计数了解炎症细胞浸润情况及气道阻力测定三方面来了解大鼠气道炎症的改变。实验中HE染色结果显示：低浓度LPS刺激后，肺组织可见支气管、肺泡及肺间质充斥大量以EOS为主的炎症细胞，支气管壁增厚、粘膜层肿胀充血、皱折增多，平滑肌增厚，管腔狭窄。而高浓度LPS剌激后上述现象明显减轻。我们通过气道壁EOS计数得到了相符的结论，低浓度LPS刺激后气道壁EOS数较哮喘组增多，而高浓度LPS刺激后EOS数较哮喘组减少，这与肺组织病理改变相符。实验中大鼠气道阻力结果显示，低浓度LPS刺激后大鼠气道阻力较哮喘组变化不大，而高浓度LPS刺激后气道阻力较哮喘组降低，这一结果与前述结果基本一致。实验结果提示：低浓度LPS刺激后加重哮喘炎症反应，高浓度LPS刺激后哮喘气道炎症减轻，LPS对哮喘气道炎症的发展可能存在双向调控作用。这与一些学者研究发现的关于LPS暴露水平不同决定机体产生不同炎症反应类型的结论相一致。其机制可能为，当过敏原或异己抗原成分进入气道并发生哮喘炎症时，EOS受特定趋化因子的作用穿过毛细血管壁到达发生变态反应的部位，首先吞噬抗原抗体复合物，随即释放组胺酶、芳香硫酸酯酶灭活白三烯，发挥抑制变态反应的作用，另一方面细胞发生脱颗粒释放EOS阳离子蛋白，导致气道上皮发生损伤，进而引发气道慢性炎症[6-7]。

气道重塑以气道慢性炎症为发生基础，是气道炎症慢性化发展的必然结果，由于气道长期持续性的炎症反复发作，反复修复，结果导致气道壁结构变化、组织增生而发生重塑[8]。经标化后的气道壁和平滑肌层厚度的测量数值可以消除不同个体及不同部位来源的支气管比较时所造成的差别，是判断气道重塑的客观指标。我们的实验结果显示，高浓度LPS刺激后大鼠支气管壁（WAt/Pi)及支气管壁平滑肌层厚度（WAm/Pi)明显低于哮喘组气道壁的厚度，说明高浓度LPS可能对气道平滑肌在气道重塑过程中有减轻作用。而低浓度LPS组气道壁厚度增加，可见低浓度LPS刺激后气道的炎症反应加重，从而加重道重塑。LPS对哮喘气道重塑的发展可能存在双向调控作用。推测可能是因为低浓度LPS剌激后ASMCs分泌Th2型细胞因子增多，抑制Thl型细胞因子分泌，从而加重气道炎症造成的[9]。

LPS是TLR4的主要配体，在哮喘的发病中TLR4发挥着重要的作用[10]。为进一步明确LPS在哮喘发病机制中的作用机制，本研究对大鼠气道平滑肌TLR4表达进行了测定。本实验研究发现，低浓度与高浓度LPS剌激后，气道平滑肌TLR4mRNA表达水平均上调，高浓度LPS刺激后较低浓度LPS刺激后TLR4mRNA表达水平上调明显。结果提示，TLR4mRNA的表达随LPS浓度的增高而增加。结合上述关于气道炎症和气道重塑的实验结果分析，当低浓度LPS刺激后，哮喘大鼠气道平滑肌TLR4表达上调，肺组织炎症改变加重，气道壁EOS增多，并且气道阻力升高，气道壁厚度增加；高浓度LPS刺激后，TLR4表达较低浓度组上调明显，而肺组织炎症改变减轻，气道壁EOS相对减少，气道阻力降低，气道壁厚度减轻。由此推测，TLR4在哮喘气道炎症及气道重塑中发挥重要作用，而低浓度及高浓度LPS刺激TLR4后，肺组织的改变不同，可能是因为TLR4介导的不同的信号通路引起不同的气道炎症及气道重塑的改变造成的[3]。但是更高浓度的LPS刺激后是否会加重哮喘气道炎症及气道重塑，有待于我们进一步实验研究。

综上所述，TLR4在哮喘气道炎症及气道重塑中起重要作用，LPS通过激活TLR4在哮喘气道炎症及气道重塑的发病过程中可能发挥双向调控作用。但是，环境中LPS的暴露水平应如何控制，并且LPS诱导的TLR4上、下游信号转导通路十分复杂，有关这些还有待于进一步研究。

参考文献

[1]宋洪娟.清金化痰汤通过P38MAPK/NF-κB信号通路改善大鼠急性气道炎症的作用和机制[D].成都中医药大学,2017.

[2]李斌恺,赖克方,沈璐,王法霞.BCG-LPS对哮喘小鼠气道炎症和气道反应性的影响[J].岭南急诊医学杂志,2016,21(06):553-555.

[3]庞敏,王冬,李婷,王丹,袁丽荣,郭民,王海龙.重组大鼠CC16蛋白质对LPS诱导大鼠气道上皮细胞表达TNF-α、IL-6和IL-8的影响[J].中国病理生理杂志,2016,32(10):1843-1847.

[4]赵柯婷.LPS及Poly（I:C）刺激RSV感染后期小鼠气道炎症和气道高反应性变化及其机制的研究[D].重庆医科大学,2016.

[5]陈冰.脂多糖协同多聚左旋精氨酸诱导NCI-H292细胞分泌IL-6、IL-8的JNK信号通路研究[D].安徽医科大学,2016.

[6]王胜,熊玲玲,邓雪,周群,李春颖,任薇,朱春冬.氨茶碱和辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症和气道黏液高分泌的影响[J].中南大学学报(医学版),2016,41(01):37-43.

[7]马力,王亚亭.脂多糖对幼年哮喘大鼠Toll样受体4及气道炎症的作用[J].河北医药,2014,36(20):3068-3070.

[8]周娜,谢晓虹,邓昱,臧娜,李伟,王莉佳,刘恩梅.脂多糖对呼吸道合胞病毒感染小鼠气道炎症及气道高反应性的影响及其机制研究[J].免疫学杂志,2014,30(10):855-859.

[9]谯明,张建勇.吸入脂多糖对哮喘小鼠气道炎症和气道黏液分泌的影响[J].四川大学学报(医学版),2014,45(03):432-436.

[10]喻蓉.脂多糖诱导髓源抑制性细胞对哮喘小鼠气道炎症影响研究[D].南方医科大学,2014.