活血止痛散质量标准研究

张莉1马毅2*晋玲2王振恒2张

1瓜州县人民医院(甘肃瓜州7361000)2甘肃中医学院药学系3兰州铁路卫生监督所

【摘要】目的建立活血止痛散的质量标准。方法采用薄层色谱法鉴别组方中赤芍、红花、川芎、木香四味药；采用高效液相色谱法测定组方中赤芍所含药理活性成分芍药苷的含量。结果薄层色谱鉴别斑点清晰；芍药苷进样量在75～125μg·mL-1范围内线性良好，平均回收率为97.8%，RSD为1.23%。结论所用方法简单、准确，可有效控制活血止痛散的质量。

【关键词】活血止痛散；薄层色谱鉴别；高效液相色谱法；芍药苷

［中图分类号］R969［文献标识码］A［文章编号］1810－5734(2011)8-00-

TheQualityStandardStudyofHuoxuezhitongPowder

ZhangLi1MAYi2*JINLing2WANGZhen-Heng2ZHANGYan-Ling3(1.People'sHospitalofGuazhouConuty,Jiuquan736100,China;2.GansuChineseTraditionalMedicalCollege,Lanzhou730000,China;3.HygieneSupervisingofLanzhouRailway,Lanzhou730000,China)

【ABSTRACT】Objective〖WTBZ〗ToestablishthequalitystandardofHuoxuezhitongPowder.MethodsPaeoniaeRadixRubra,FlosCarthami,ChuanxiongRhizoma,AucklandiaeRadixinHuoxuezhitongPowderwereidentifiedbyTLC,andcontentofpaeoniflorinwasdeterminedbyHPLC.ResultsThemethodforidentificationhadgoodspecificityandrepeatability.Therewasnointerferenceinblankcontrol.HPLCmethodestablishedissimply，accurateandhasagoodlinearityintherangof0.75～1.25μgwithameanrecoveryofpaeoniflorininashighas97.8%(RSD=1.23%)．ConclusionThe

qualitativeandquantitativemethodissimple,specific,accurateandreliable.

ItcanbeusedtoeffectivelycontrolthequalityofHuoxuezhitongPowder.

【KEYWORDS】HuoxuezhitongPowder；TCL；HPLC；Paeoniflorin

活血止痛散是由赤芍、红花、川芎、木香、桃红、独活、当归、香附等10味药组成的临床经验方，经过多年临床疗效观察，有舒筋活血消肿止痛的作用，用于治疗跌打损伤，淤血肿胀，无菌性炎症，四肢关节术后黏连肿胀，风湿骨痛。为确保有效控制该制剂的质量，我们对其质量标准进行研究，取得了满意的结果，现报道如下

1试验仪器与材料

仪器：LC-10AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）；U-3900H紫外-可见分光光度计（HITACHI日立公司）；WHF203B三用紫外分析仪（天津思利达科技有限公司）；HS2060A超声波清洗器。

试剂：含量测定用甲醇为色谱纯，水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

试药：制备3个批次供试品均由瓜州县人民医院提供；川芎对照药材（批号：120918-200809）、红花对照药材（批号：907-9905）、芍药苷对照品（批号：110736-200630）均购自中国药品生物制品检定所

其他：硅胶G薄层板（安徽良臣硅源材料有限公司），硅胶H薄层板（青岛海洋化工厂）。

2方法与结果

2.1制剂制法

将赤芍、红花、川芎、木香、桃红、独活、当归、香附等10味中药按处方剂量称量配齐，混合粉碎成细粉，过筛，混匀即得。

2.2薄层色谱鉴别

红花取阳性供试品粉末3g，置具塞锥形瓶中加80%丙酮溶液10mL，超声提取15min，取出，静置，吸取上清液，作为阳性供试品溶液。另取阴性供试品（无红花）粉末3g，同法制成阴性供试品溶液。再取红花对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照《中国药典2005年版一部》附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各3μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇（7：2：3:0.4）为展开剂，展开，取出，晾干。阳性供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点（桔红色）。而阴性供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，不显相同颜色的斑点。如图1：

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12345图1红花薄层色谱图（T：20℃RH：38%）

1～3.供试品4.阴性供试品5.红花对照药材

川芎取阳性供试品3g，加石油醚（60-90℃）振摇提取2次，每次20mL，合并石油醚液蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为阳性供试品溶液。另取阴性供试品（无川芎）3g，同法制成阴性供试品溶液。再取川芎对照药材0.5g，加乙醚15mL，超声处理15分钟，滤过，滤液挥干乙醚，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（附录VIB）试验，吸取阳性供试品溶液与阴性供试品溶液各10?L，对照药材溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-氨溶液（9:2:0.2）为展开剂，展开，晾干，置紫外灯365nm下检视，阳性供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性供试品在与对照药材及阳性供试品色谱相应的位置上，不显色斑。如图2：

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图2川芎薄层色谱图（T：20℃RH：50%）

1.阴性供试品2～4.供试品5.川芎对照药材

木香取阳性供试品3g，加乙醚振摇提取2次，每次20mL，合并乙醚液，挥发至约1mL，作为阳性供试品溶液。另取阴性供试品（无木香）3g，同法制成阴性供试品溶液。再取木香对照药材0.5g，加乙醚20mL，超声处理10分钟，过滤，滤液挥发至1mL，作为对照药材溶液，照薄层色谱法（附录VIB）试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸（10:3:0.3）为展开剂，展开，取出晾干，喷以1%香草醛乙醇溶液-硫酸（1:1）混合溶液，105℃加热至斑点显色清晰。阳性供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性供试品在与对照药材及阳性供试品色谱相应位置上无显色。如图3：

图3木香薄层色谱图（T：20℃RH：50%）

1.阴性供试品2～4.供试品5.木香对照药材

赤芍取阳性供试品3g，加正丁醇提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加正丁醇1mL使溶解，作为阳性供试品溶液。另取阴性供试品（无赤芍）3g，同法制成阴性供试品溶液。再取芍药苷对照品适量，加乙醇制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法（附录VIB）试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40:5:10:0.2）为展开剂，展开，取出晾干，喷以5%香草醛硫酸乙醇（1→10）溶液，105℃加热至斑点显色清晰。阳性供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性供试品在与对照品及阳性供试品色谱相应位置上不显相同颜色斑点。如图4：

图4赤芍薄层色谱图（T：20℃RH：50%）

1.阴性供试品2～4.供试品5.芍药苷对照品

2.2芍药苷的含量测定

2.2.1色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：InertsilODS-SP(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为：乙晴-0.1%磷酸溶液（28：72），流速：1.0mL·min-1；检测波长：230nm；柱温：30℃；进样量：10μL。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于2000，分离度（R）应大于1.5。

2.2.2对照品溶液的制备

精密称取芍药苷适量，加甲醇制成100μg·mL-1芍药苷对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备

取本品粉末约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理(功率350W，频率35kHz)10min，放置过夜，同法超声处理一次，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液3mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.4专属性考察试验

按处方制备不含白芍药材的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成相应的阴性样品溶液，备用。取对照品溶液、阴性样品溶液及供试品溶液，在上述色谱条件下各进样10?L，分别记录色谱图（见图5）。结果供试品与对照品保留时间一致，阴性样品溶液在相同位置未出现相应色谱峰，表明该方法专属性较好。

A

B

C

图5活血止痛散HPLC色谱图

A.对照品B.阴性样品C.供试品样品

2.2.5线形关系考察精密称取芍药苷对照品约6.3mg，置50mL容量瓶中，加甲醇40mL，振摇使溶解，加正丁醇至刻度。精密量取上述溶液10mL，9mL，8mL，7mL，6mL，分别移置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，再分别用0.45μm微孔滤膜滤过，在上述色谱条件下，各进样20μL，每个浓度重复进样3次，以芍药苷峰面积平均值对其浓度C（μg·mL-1）计算回归方程，结果为：A＝-4.11×104C+6.98×106（r＝0.9990）。表明，芍药苷浓度在75～125μg·mL-1的范围内与其峰面积呈量好的线形关系。

2.2.6精密度考察精密量取100mg·ml-1对照品溶液连续重复进样5次，其峰面积RSD＝0.46%。

2.2.7稳定性试验取同一批号(批号:20101226)的样品溶液，配制后立即测定1次（0h），再于室温中放置2h、4h、6h、8h后再进样，测得芍药苷峰面积的RSD＝0.67%（n＝5）；再于室温中放置0.5d、1d、2d、3d、4d后再进样，测得芍药苷峰面积的RSD＝1.54%（n＝5）。表明该方法的稳定性好，符合高效液相色谱法测定的需要。

2.2.8重复性试验取同一批号(批号:20101226)的样品5份，按样品溶液的配制项方法配制样品溶液，按上述方法测定，结果芍药苷峰面积的RSD＝1.01%（n＝5）。表明该方法的重复性好。

2.2.9加样回收率试验精密称取已知含量的样品细粉9份，每份约3.0g，均分为3组。

每组分别精密加入对照品芍药苷约2.70mg，2.25mg，2.0mg。同样品测定项法制备溶液并测

定芍药苷的含量，芍药苷的平均回收率为97.8%，RSD为1.23%。结果表明，该方法回收率良

好。

2.2.10样品含量的测定：对照品溶液和样品溶液各进样20?l，按上法测定，用外标法以峰面积计算含量。本品每1g含白芍以芍药苷（C23H28O11）计不得少于0.70mg，见下表1：

表1样品含量测定结果（n＝5）

3讨论

本试验参照有关文献［１］，经反复优化筛选展开剂、固定相、显色剂等检测条件，对大黄通气口服液处方中的红花、川芎、木香、赤芍进行了TLC鉴别。结果表明，所建立的红花、川芎、木香、赤芍的TLC鉴别方法专属性强，分离度好。芍药苷的含量测定方法有分光光度法、薄层扫描法、高效毛细管电泳法和高效液相色谱法等［2—4］。根据适用性原则，采用高效液相色谱法完全能满足芍药苷测定的准确度、灵敏度及重现性的要求，设备要求条件适合广泛应用。笔者在本实验中获得了较佳的效果。

目前，对于用高效液相色谱法测定制剂中芍药苷含量研究主要采用不同比例的乙腈-水(磷酸、乙酸或者甲醇)、甲醇、异丙醇-冰乙酸-水和甲醇-水等3大类系统作流动相［２］。笔者曾对流动相的选择进行摸索，调整原流动相乙腈-水的比例，但分离度几无改进，甲醇-水虽有改进，但仍达不到基线分离，甲醇-乙腈-磷酸分离度很好，但保留时间过长，故最终选择能达到基线分离且保留时间适中的乙晴-0.1%磷酸溶液（28：72）作流动相，取得了满意的分离效果。实验过程中采取回流提取和超声波提取，经比较发现超声波提取法时间短、提取物中杂质少，直接测定可以达到完全分离。笔者也对超声时间进行了考察，发现超声10，20,30min均不能提取完全。最后采取超声10min，放置过夜，同法超声处理一次后提取较完全。

通过方法学的考察，确定笔者在本实验中采用的测定方法具有精密、准确和稳定的特性，回收率也符合有关要求。因此，此法可以用于活血止痛散中芍药苷的含量测定。

参考文献

［１］国家药典委员会编.《中国药典》2005年版,一部［S］.2005:58，附录6,附录18,附录31，附录33,附录114

［2］方世平，刘萍，杨瑜，等．芍药苷的含量测定方法概述．医药导报，2004，23(增刊)：1-4．

［3］贾金萍，秦雪梅，王光丽，等．高效液相色谱法测定鞭芍胶囊中芍药苷的含量．中国医院药学杂志，2005，25(2)：136—137．

［4］杨丽．HPLC法测定千金止带丸中芍药苷的含量．中国药事，2007，21(6)：422-423．