被动皮肤过敏试验剂量设计探讨

贾芳芳沈姣岳鹏蔡鸣刘晶

(南京工业大学江苏省药物研究所210009)

【摘要】目的探讨被动过敏试验的剂量设计。方法以注射用盐酸吉西他滨为供试品，设计被动过敏试验，并观察试验结果。结果注射用盐酸吉西他滨被动皮肤过敏试验结果为阴性。结论抗肿瘤类药物的被动皮肤过敏试验，应按动物暴露剂量下的实际耐受情况，合理设计PCA试验的暴露剂量水平。

【关键词】被动皮肤过敏注射用盐酸吉西他滨剂量设计

【中图分类号】R965.3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）18-0046-02

被动皮肤过敏试验（passivecutaneousanaphylaxis,PCA），是利用同种或异种动物组织有结核性的抗体所引起的局部过敏反应，用来检验抗体或抗原的高敏感度方法。本实验中将致敏小鼠的血清（内含丰富的IgE抗体）皮内注射于正常大鼠，有结核性的抗体（IgE）与皮肤肥大细胞的特异受体结合，使之被动致敏，当致敏抗原激发时，引起局部肥大细胞释放过敏介质，从而使局部血管的通透性增加。然后向抗原液内混入依文思蓝（Evans）色素，再注入大鼠静脉内，其抗原则在抗血清注射部位与附着在肥大细胞上的抗体起反应，注入的燃料可渗出于皮丘，形成蓝斑。测定蓝斑的直径，做为过敏反应的指标[1]。

药物安全性评价中，抗肿瘤药物是不可缺少的一环，而抗肿瘤药物往往伴随着对机体细胞的杀伤和抑制，例如注射用盐酸吉西他滨是一种人工合成的新型二氟核苷类抗代谢抗肿瘤药，临床上主要用于治疗局限晚期或已转移的非小细胞肺癌，局限晚期或已转移的胰腺癌[2]。其对血液系统作用产生的不良作用主要有对骨髓产生抑制作用，可出现贫血、白细胞降低和血小板减少[3]。笔者以注射用盐酸吉西他滨为例，探讨药物安全性评价中如何合理进行抗肿瘤药物的剂量设计。

1材料和方法

1.1材料

实验动物：24只SPF级BALB/c小鼠，体重20-22g；24只SPF级SD大鼠，232-256g。动物均为雌雄各半，购于中国人民解放军第四军医大学实验动物中心。小鼠饲养于塑料盒内，雌雄分开，每盒3只；大鼠饲养于托盘饲育架(164×44×164cm)上的悬吊式不锈钢饲育笼(40×30×20cm)内，雌雄分开，每笼3只。动物室温度：20-26℃；相对湿度：40-70％；照明：150-300Lux(明暗各12h)；噪音：60dB以下；换气次数：10-18次/小时。动物饲料采用全价鼠颗粒饲料，购于江苏协同生物工程有限公司，批号20100522；小鼠垫料采用复合垫料，购于江苏协同生物工程有限公司，批号20100529。

实验所用供试品及其他试剂相关信息见表1。

表1供试品及试剂相关信息

1.2方法

致敏阶段将小鼠24只分为4组，每组6只雌雄各半，分成注射用盐酸吉西他滨高剂量组、低剂量组、溶媒对照组和阳性对照组。分别腹腔给予注射用盐酸吉西他滨0.2ml/只，溶媒对照0.2ml/只、卵白蛋白5mg/只，以2％氢氧化铝凝胶为佐剂。给药体积均为每鼠0.2ml，隔日1次，共3次。末次致敏后14天，摘眼球取血，2000rpm离心10min，制备血清。每组6只动物血清合并，制成混合抗血清，-20℃保存。

激发阶段将SD大鼠分为如上4组，背部两侧毛剃净，在背中线两侧，距脊柱1.5cm处，每侧选取2个点，每点间隔1.5～2cm。取上述两种含IgE的抗血清，经用生理盐水等倍稀释抗血清至4个梯度，依次在上述各点皮内注射不同稀释倍数的抗血清，体积均为0.1ml。24h后注射用盐酸吉西他滨致敏血清的大鼠，静脉给予注射用盐酸吉西他滨和等体积的0.5％伊文思蓝混合液(1ml/只)，进行抗原激发；注射溶媒对照致敏血清的大鼠，静脉给予溶媒对照和等体积0.5％伊文思蓝混合液(1ml/只)，进行抗原激发；注射卵白蛋白致敏血清的大鼠，静脉注射卵白蛋白(25mg)和等体积的0.5％伊文思蓝混合液1ml，进行抗原激发。30min后断颈处死动物，翻转背部皮肤，测定蓝色反应斑的直径，以其平均值＞5mm为阳性，不规则斑点直径为长径与短径之和的一半。过敏反应表示成出现阳性反应的最大稀释倍数[4]。

1.3试验设计

注射用盐酸吉西他滨的成人临床用量为1000mg/m2（60kg成人体表面积约为1.620m2，按成人体重60kg计，成人推荐用量为27mg/kg），周期为1次/周，而在《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》[4]中要求，致敏间隔为隔日一次，共3-5次；受试物低剂量组给予临床最大剂量（/kg或m2），受试物高剂量组给予低剂量的数倍量[4]。

而注射用盐酸吉西他滨做为抗肿瘤药，短时间内的多次给药势必会引起小鼠机体的变化，有可能对实验结果产生影响。因此在正式实验进行之前，进行预实验是非常有必要的。

预试验采用高、中、低3个剂量组，给药剂量分别为250mg/kg、125mg/kg、62.5mg/kg，每组采用6只成年小鼠，雌雄各半，给药体积为0.2ml/只，隔日一次，共3次，末次致敏后观察14天处死小鼠，观察给药后至观察期结束小鼠的存活状况。

在预试验结束后，根据实验结果，确定供试品高、低剂量，各组动物给药体积为0.2ml/只，隔日一次，共3次，末次致敏后观察14天，观察第14天时摘眼球取小鼠血清，对大鼠进行致敏，致敏24小时后对大鼠进行激发。

1.4数据统计

大鼠激发后如有蓝色反应斑，则测定蓝色反应斑的直径，不规则斑点直径为长径与短径之和的一半，以SPSS13.0计算均数及标准均方差。

2结果

注射用盐酸吉西他滨大鼠被动皮肤过敏预试验结果见表2。

表2注射用盐酸吉西他滨预试验结果

注：在第3次致敏后观察期开始的3天内，高、中剂量组动物全部死亡。

给药期间，各组动物均出现背部竖毛、运动减少的现象，在给药结束后5min后恢复运动。在第3次致敏后观察期开始的3天内，高、中剂量组全部死亡。考虑到62.5mg/kg组动物有轻微中毒现象，在正式试验中，将高剂量定为50mg/kg，约为成人用推荐剂量1.85倍（成人体重按60kg计），低剂量为25mg/kg，约为成人用推荐剂量0.925倍。

正式试验开始后，高、低剂量组小鼠未发生中毒或死亡现象，至观察期结束后取血处死，并对大鼠进行致敏激发。激发后试验结果表明，静注注射用盐酸吉西他滨高、低剂量组以及溶媒对照组后，动物均未出现被动皮肤过敏反应；静脉注射卵白蛋白后，大鼠被动过敏反应呈阳性，结果见表3。

表3注射用盐酸吉西他滨大鼠被动皮肤过敏反应结果

注：X±SD，n=6

3.讨论

PCA试验的主要目的并不是为了找出动物的中毒剂量或中毒靶器官，致敏阶段要保证动物暴露在毒物中后能够存活下来，进而保证试验的顺利进行，虽然低剂量略低于成人推荐剂量，但并不会因为剂量过低而引起供试品假阳性或假阴性结果[4]，判定注射用盐酸吉西他滨被动皮肤过敏试验结果为阴性。

在药物安全性评价局部毒性试验中，抗肿瘤类药物对试验动物机体的损害作用较为严重，在设计试验方案时，不仅应考虑药物的暴露剂量水平，还考虑动物暴露剂量下的实际耐受情况。因此我们要根据不同药物的药理、毒理作用，依据《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》[4]，设计合理的试验方案，才能真正做好药物安全性评价工作。

参考文献

[1]袁伯俊,廖明阳,李波.药物毒理学实验方法与技术[M].北京:化学工业出版社.2007:242-249.

[2]范玮，李安琪.盐酸吉西他滨对慢性粒细胞白血病急变期细胞增殖凋亡的影响[J].临床医学,2011,31(5):95-96.

[3]GiovannettiE,MeyV,LoniL,etal.Cytotoxicactivityofgemcitabineandcorrelationwithexpressionprofileofdrug-relatedgenesinhumanlymphoidcells[J].PharmacologicalResearch,2007,55(4):343-349.

[4]国家食品药品监督管理局组织编写.药物研究技术指导原则.北京:中国医药科技出版社.2006:116-132.