联合诱导法制备大鼠肝S9及蛋白含量的测定

余大为侯言东(通讯作者)

【中图分类号】R446.63【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）22-0196-02

【摘要】目的测定联合诱导法和多氯联苯诱导法制备的大鼠肝S9的蛋白含量并对这两种方法进行比较。方法采用苯巴比妥与β—萘黄酮合并诱导所获S9作为诱导剂制备大鼠肝S9,并采用Bradford法测定所制备的S9蛋白含量。结果成功制得大鼠肝S9,并测定其蛋白含量为26.73mg/ml。结论联合诱导法可以替代多氯联苯诱导法制备肝匀浆S9。

【关键词】联合诱导法S9制备蛋白含量测定

PreparationofratliverS9bycombinationinducingmethodanddeterminationofproteininthepreparedS9

YuDawei,Houyandong*,

(GansuProvincialCenterforDiseaseControl＆Prevention,Lanzhou730000)

【ABSTRACT】Objective:TodeterminethecontentofproteininratliverS9preparedbycombinationinducingmethodandPCBinducingmethodandcomparethetwomethods.Methods:RatliverS9waspreparedusingS9obtainedbycombinationinducingmethodwithphenobarbitalandβ-naphthoflavoneastheinducerandthecontentofproteininthepreparedS9wasdeterminedbyBradfordmethod.Results:RatliverS9wassuccessfullypreparedandtheproteincontentwas26.73mg/ml.Conclusion:CombinationinducingmethodmaysupersedePCBinducingmethodforpreparationofliverhomogenateS9.

【Keywords】combinationinducingmethodS9preparationproteindetermination

多氯联苯(Polychlorinatedbiphenyls,PCBs)是一种极其稳定的致癌剂，目前环境中所存在的10亿多磅多氯联苯已引起人们的关注。由于多氯联苯理化性质极为粘稠稳定很难处理，加之对动物尸体的处置也存在着一定的麻烦，同时因S9组分含有少量的多氯联苯残留物，故其与其他致癌剂相比，多氯联苯对实验室工作人员有着更大的潜在危害。为此去寻找一种可用于诱导S9的多氯联苯替代物将会给工作带来益处。[1]Matsushima等人比较两种诱导剂的诱导效果，发现用苯巴比妥(Phenobarbital,PB)与β—萘黄酮（Benzoflavone,BF)合并诱导所获S9的活化力与多氯联苯所获结果相似。[2]因此,本文采用苯巴比妥与β—萘黄酮合并诱导作为诱导剂,制备S9,并采用Bradford法测定所制备的S9的蛋白含量,进而研究有效的S9代谢活化酶系统制备方法和测定方法。

1.试药与仪器

1.1药品与试剂

KCl(分析纯),苯巴比妥(分析纯),β—萘黄酮,多氯联苯(天津疾控毒理学部提供),MgCl2，6H2O(分析纯)PBS缓冲液(自配),6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate,Sigma,美国),烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶Ⅱnicotinamide-adeninedinucleotidephosphate,NADP,Sigma,美国),Bradford法蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.2仪器

冷冻高速离心机(Beckman,AllegraTM2-16K,美国)；紫外可见分光光度计

1.3实验动物及饲养条件

SPF级Wistar大鼠（甘肃省中医学院实验动物研究中心提供）12只,雄性，体重200～220g,大鼠饲养于甘肃省疾病预防控制中心毒理室SPF动物房。温度20～25℃,相对湿度55%±15%,换气次数10～20次/h。

2.方法

2.1肝酶系统的诱导

用苯巴比妥与β—萘黄酮合并诱导制备大鼠肝脏S9[3]。大鼠腹腔注射PB,每天1次,d1剂量为,30mg•kg余下3d每天剂量为60mg•kg。d3,4天腹腔注射BF。每天1次,d1剂量为,80mg•kg。大鼠在首次注射后d5天处死。多氯联苯诱导:大鼠腹腔注射1次PCBs,剂量为500mg•kg-1,大鼠在注射后d6处死。

2.2大鼠肝S9的制备

取用苯巴比妥与β—萘黄酮合并诱导的大鼠,处死后立即无菌条件下冲洗并取出肝脏.立即用4℃含有1.15%ofKCl的0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.4)灌洗肝脏。再按3ml/g湿重的比例加入含有1.15%ofKCl的0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.4)于冰浴中匀浆.合并匀浆,并于冷冻高速离心机中9000×g离心30min,取其上清液即为S9[4]。S9分装于冻存管中,速冻后,保存于液氮罐中。

2.3Bradford法测定S9中蛋白含量

2.3.1标准曲线的绘制

取7个带盖的1.5ml离心管,编好号后,按下表顺序加入试剂：

表1Bradford法操作步骤

每管加入2.85ml考马斯亮蓝染液，混匀,室温放置5-10分钟：用分光光度计测定595nm处的吸光值，并记录读数；以不含BSA的样品的光吸收值作为空白对照。以蛋白含量(mg)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线。

2.3.2自制S9样品的蛋白浓度测定

分别取3份分装后的大鼠肝S9样品,先稀释40倍，然后取40μl，用PBS补足到150μl，再加入2.85ml考马斯亮蓝染液，立即混匀，室温放置5-10分钟，以标准曲线0号管做参比，在595nm波长下比色，记录吸光值。根据所测样品的吸光值，由标准曲线计算相应的蛋白含量（mg），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度。

3.结果

3.1Bradford法测定蛋白含量的标准曲线

按照Bradford法,采用牛血清白蛋白（BSA）标准溶液进行测定,将蛋白含量对紫外可见吸收值(OD)作图,得到标准曲线,OD=10.069×C+0.2173R2=0.9993，线性关系良好,线性范围为：0.01mg-0.06mg.

3.2自制大鼠肝S9蛋白质含量的测定

根据3份自制大鼠肝S9稀释液测得的平均吸光度(OD值),带入蛋白含量测定标准曲线,即可求得平均蛋白含量.测得所制备的大鼠肝S9平均蛋白含量为26.73mg/ml。

表2自制大鼠肝S9蛋白含量测定结果

4.讨论

在制备S9混悬液过程中,应注意用新鲜冰冷的0.15mol/l氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次,以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。所制备得到的S9应测定蛋白浓度,本实验应用Bradford法测定大鼠肝S9蛋白浓度,通过比较本次试验结果可以大致认为两种诱导方法制备的S9蛋白质含量无明显差异，联合诱导法可以替代多氯联苯诱导法制备大鼠肝S9。

参考文献

[1]翟育忠，刘建业.沙门氏菌诱变试验(译).甘肃科学技术出版社，1988.22-23.

[2]王亚其,李宏霞,肖凯,等.两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中活性比较[J].现代预防医学,2006,

[3]黄幸纾,陈星若.环境化学物致突变、致畸、致癌试验方法[M].杭州:浙江科学技术出版社,1985.32-33.

[4]何黎黎,杨立开,邓黎，等.S9代谢活化酶系统制备及蛋白含量的测定.西南民族大学学报,第36卷第2期.