实时荧光RT-PCR检测手足口病病毒核酸的临床应用价值

黄琼

【摘要】目的探讨实时荧光RT-PCR检测手足口病病毒核酸的临床应用价值。方法采集县中医院2015年3月-2016年3月收治的疑似手足口病患儿的咽拭子或疱疹液或粪便标本，共采集标本200份，从标本中提取病毒RNA，并采用实时荧光RT-PCR法进行检测，分析检测结果。结果本组200份标本经实时荧光RT-PCR检测共检出阳性标本178份，阳性率为89.0%，阴性22份。阳性标本中CoXA16病毒占比72.5%，EV71病毒占比19.7%，其他肠道病毒占比7.3%。2015年3月-2016年3月期间本地手足口病毒以CoXA16型为主。结论实时荧光RT-PCR检测技术在手足口病病毒核酸检测中具有操作简单、快速、灵敏度高的优势，可作为手足口病早期诊断的首选检测方法。

【关键词】实时荧光RT-PCR；手足口病；病毒核酸

[Abstract]objectivetoinvestigatetheclinicalapplicationvalueofhft-pcrinreal-timefluorescencert-pcr.MethodstocollectcountyhospitalinMarch2015-March2016suspectedchildrenwithhand，footandmouthdiseaseinourhospitalpharyngealswaborherpesfluidorstoolspecimens，atotalof200samples，theviralRNAextractedfromthespecimen，andUSESthereal-timefluorescentrt-pcrmethodfordetectionandanalysisoftestresults.Resultsthesamplesof200specimensweretestedpositivefor178，andthepositiveratewas89.0%andnegative22.TheCoXA16virusaccountedfor72.5percentofthepositivespecimens，andtheEV71virusaccountedfor19.7percent，whiletheotherenterovirusesaccountedfor7.3percent.FromMarch2015toMarch2016，thelocalHFMDviruswasdominatedbyCoXA16.Conclusionreal-timefluorescentrt-pcrdetectiontechniqueinthehand，footandmouthdiseasevirusnucleicaciddetectionhastheadvantagesofsimpleoperation，rapid，highsensitivity，andcanbeusedasearlydiagnosticmethodofchoiceforhand，footandmouthdisease.

[Keywords]real-timefluorescentrt-pcr；Hand，footandmouthdisease；Thevirusnucleicacid

手足口病是临床常见传染性疾病，该病由多种肠道病毒及其他微生物感染引起，是儿童常见疾病。资料显示，婴幼儿是手足口病的多发人群，多数患儿症状轻微，多表现为手、足、口等部位疱疹或皮疹，少数患儿病情较重，出现高热、呕吐、恶心、寒颤等，可并发心肌炎、无菌性脑膜炎、脑炎等病，严重的可导致患儿死亡。研究发现，导致手足口病的肠道病毒有A组柯萨奇病毒（CoXA16）、肠道病毒71型（EV71）、埃可病毒（ECHO）等，且具有较强的传染性，易引起爆发或流行[1]，因此，快速、高效、准确的对肠道病毒进行检测具有极其重要的临床意义。有文献报道，实时荧光RT-PCR技术在检测病毒核酸方面有较高的灵敏度和特异性，且检测时间只需4-6h。为了进一步探讨该检测技术在手足口病病毒核酸检测中的应用价值，特开展本研究。

1资料与方法

1.1标本来源

本研究标本采集自县中医院2015年3月-2016年3月收治的疑似手足口病患儿的咽拭子或疱疹液或粪便标本，共采集标本200份，标本采集后置入专用生物样品运送箱内，并尽快送入本区疾病预防控制中心进行实验室检测。

1.2方法

1.2.1仪器及试剂盒

仪器采用7500Fast型（美国appliedbiosystems公司提供）实时荧光定量PCR仪，人肠道病毒试剂盒采用中山大学达安基因股份有限公司生产的CoXA16、EV71荧光PCR测试剂盒，采用德国Qiagen公司生产的核糖核酸（RibonucleicAcid，ＲNA）提取试剂盒。

1.2.2操作方法

（1）RNA的提取。标本RNA的提取严格按照德国Qiagen公司的核糖核酸提取试剂盒说明书操作，抽提结束后即刻进行ＲNA检测。（2）实时荧光RT-PCR检测。严格按照试剂盒说明书进行EV71、CoXA16等人肠道病毒检测操作：①PCR反应体系。总体积为25μl，其中包括15μl的CoXA16（EV71）RT-PCR反应液，5μl的模板，3μl的Tag酶系，2μl的逆转录酶系。②反应条件。温度为40℃，逆转录25min1，1个循环，然后设置温度为94℃条件，进行3min变性，1个循环，再以93℃条件下15s’→55℃条件下45s’，进行40个循环。③质量控制。先进行基线调整，并进行阈值设定。以满足阳性对照FAM通道的Ct值≤35且同时DEPC-H2O通道显示无Ct值来控制实验的有效性。④结果判定[2]。严格按照试剂盒说明书所列参考值进行检测结果的判定，CoXA16病毒、肠道病毒、EV71病毒均以Ct值＞38.46判定为阴性，CoXA16病毒的Ct值＜35.86，同时具有典型扩增曲线，判定为阳性，EV71病毒的Ct值＜35.29，同时具有典型扩增曲线，为阳性；肠道病毒Ct值＜35.62，同时具有典型扩增曲线，为阳性。

1.3统计学分析

研究数据采用EXCEL2013整理分析，连续性资料采用均值±标准差进行描述；分类资料采用构成比（%）进行描述。

2结果

本组200份标本经实时荧光RT-PCR检测共检出阳性标本178份，阳性率为89.0%，另外22份标本为阴性。阳性标本中CoXA16病毒占比72.5%（129/178），EV71病毒占比19.7%（35/178），其他肠道病毒占比7.3%（13/178），见表1。可见，2015年3月-2016年3月期间本地手足口病毒以CoXA16型为主。

3讨论

手足口病是一种世界性传染性疾病，多数国家均发生过该病的流行。该病病因复杂，多数患者由于肠道病毒CoXA16及EV71感染引起，感染该类病毒后，患者肠道黏膜腺体和全身循环系统均可出现神经系统受累表现[3]，不过，多数患者均有轻微表现，且可在1周内自愈，预后良好，而重症患儿则可引起明显的脑膜刺激，并可导致呼吸循环功能衰竭，威胁患儿身体健康及生命安全[4]。

研究者认为，早期诊断对手足口病患儿尤其是重症患者有极其重要的意义，不但可显著提高临床疗效，而且可提高重症患儿的生存几率。骆玲飞等[5]研究指出，手足口病流行时期，可通过观察幼儿的口腔、手足部位的皮疹分布来协助临床早期诊断。但部分患儿并无早期典型症状，而病原学检测需耗费2-4周的时间方可得到结果，临床应用受限。近年发展起来的荧光定量CPR技术以特异性荧光探针为显著特点，进行特异性较强的病原学检测，且该技术在手足口病病毒检测中具有耗时短、敏感性高的特点，可为临床早期诊断提供重要信息。余雄武等[6]研究结果显示，实时荧光RT-PCR技术可快速检测手足口病毒的CoXA16型和EV71型感染，尤其在早期检出EV71型病毒感染中具有较高的敏感性，对早诊断、早治疗、提高临床疗效有重要价值。本研究结果显示，本组200份标本经实时荧光ＲT－PCＲ检测共检出阳性标本178份，阳性率为89.0%，且以CoXA16病毒占较大比重，提示该研究期间手足口病毒以CoXA16型为主。同时，该技术具有高通量性优势，并不局限于临床检验，还可以应用于进行大规模流行病学的调查研究中

综上，实时荧光RT-PCR检测技术在手足口病病毒核酸检测中具有操作简单、快速、灵敏度高的优势，可作为手足口病早期诊断的首选检测方法。

参考文献：

[1]胡雪影，张玲.实时荧光定量RT-PCR法检测安徽宿州市手足口病病原体结果分析[J].热带病与寄生虫学，2015，13（4）：208-210，218.

[2]方静霞，沈丽萍，吴捍卫.荧光定量PCＲ和酶联免疫吸附技术在手足口病肠道病毒快速检测中的应用比较[J].儿科药学杂志，2014，20（10）：1-3.

[3]李丽琴，钟婧，周林福，等．EV71、CA16及通用型肠道病毒实时荧光定量PCＲ诊断试剂盒的研发［J］．中华实验和临床病毒学杂志，2013，27（3）：224-227．

[4]王美芬，陈韬，杜曾庆，等．2010年昆明及周边地区普通型与重型手足口病病原学分析［J］．中国实用医刊，2013，40（1）：30-32．

[5]骆玲飞，王小光，乔坤，等．多重荧光ＲT－PCＲ在手足口病病原检测中的应用分析［J］．中国卫生检验杂志，2013，23（10）：2283－2292．

[6]余雄武，冯琳，潘虹，等.实时荧光ＲT－PCＲ法检测手足口病病原体EV71和CA16及临床特点分析[J].中国妇幼保健，2016，31（2）：408-410.