基于海马神经元细胞研究宁神灵抗抑郁作用机制

王赫霆

【摘要】目的：研究宁神灵对抑郁症大鼠行为学及海马神经元细胞的影响。方法：正常大鼠随机分为空白组、模型组。采用慢性、不可预知性温和刺激（CUMS）结合孤养模型制作抑郁症大鼠模型，分中药治疗组（高、中、低剂量），对照组，各组15只，于第0、7、14、21、28天观察行为学指标（体重、糖水消耗实验、敞箱得分、大鼠活动延迟时间）。28天取大鼠海马组织，观察CA1、CA2、CA3、CA4区形态学变化及HE染色后脑组织的病理改变(Figure)。结果：相同时间点组间比较第7、14、21、28天行为学指标空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组。组内比较行为学指标高、中、低剂量组与时间呈正相关，空白组与对照组与治疗时间无差异。抑郁大鼠海马CA1区锥体细胞偶见散在的胞体固缩,深染或胞质溶解、空泡变性。CA4区可见少量锥体细胞胞体固缩,深染。治疗组大鼠海马区神经元排列整齐，细胞体呈椎体形，较大，核大而圆，且与中药剂量呈正相关。结论：宁神灵可能通过作用于大鼠海马神经元细胞，引起相关蛋白及递质的改变，具有抗抑郁作用。

【关键词】宁神灵；抑郁症；慢性不可预知刺激；行为学；海马神经元

【中图分类号】R749.05【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2019）04-0045-02

抑郁症是一种以显著而持久的情绪失常为特征的综合征，该病具有高患病率、高致残率、高自杀率的特点。据世界卫生组织进行的全球疾病负担调查估计，到2020年由抑郁症造成功能残疾的人数将仅次于心血管疾病，上升至所有病种的第2位，并将占到全球因精神因素致残患者的1/3，因此，抑郁症已成为亟待解决的最重要的精神障碍[1]。近年来，关于抑郁症发病机制的研究很多，大多集中在神经递质、基因和社会因素等方面，但对于抑郁症发生和发展的分子生物学机制仍尚不明确[2]。

1.材料与方法

1.1实验材料

健康雄性大鼠75只，正常大鼠随机分为空白组、模型组，采用慢性、不可预知性温和刺激（CUMS）结合孤养模型制作抑郁症大鼠模型，模型组分中药高（宁神灵5.04g/kg）、中（宁神灵2.52g/kg）、低剂量组（宁神灵1.26g/kg）、对照组。

1.2研究方法

1.2.1行为学指标观察

（1）体重测定

实验过程中每周称量一次体重观察各组大鼠体重变化及增长情况以判断抑郁状态与体重变化的关系。

（2）糖水消耗实验

根据文献所有大鼠首先受训饮用1%的蔗糖水在开始的48小时内将蔗糖水放入笼中以代替自来水接着禁食禁水24小时通过称饮水瓶重量测量大鼠在1小时内蔗糖水的饮用量此后每间隔一周均进行禁水禁食及1小时蔗糖水测试，此过程贯穿于整个实验。

（3）敞箱得分实验

将大鼠置于高40cm，直径80cm周壁为黑色底面被分成面积相等的25块方格组成的旷场里，60W灯泡照明观测每只大鼠3min内水平活动和垂直活动得分。7:30～12:00之间在安静的房间内进行此项试验观察将大鼠置于敞箱中间观察大鼠穿越方格数（四爪均进入的方格可记数，为水平活动得分）、后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分）、清洁运动次数（理毛次数）、粪便次数。彻底清洁敞箱后再进行下一只大鼠的观察。每只大鼠测试3分钟。分别在造模前、给药前及给药后进行敞箱实验。

1.2.2标本采集

（1）HE染色

取大鼠脑组织，在4%甲醛溶液中固定24-48小时，用模具测量并用刀片切取海马区，石蜡包埋，进行切片和HE染色。使用光学显微镜对大鼠海马组织切片拍照，供分析使用。

（2）电镜显微结构观察

解剖获取大鼠脑组织，将脑组织迅速放入3%戊二醛固定液在4℃条件下固定过夜。用模具测量并用刀片切取海马区作为标本进行俄酸包埋，使用电子显微镜对大鼠海马组织切片拍照，供分析使用。

2.结果

本实验表明相同时间点组间比较第7、14、21、28天大鼠体重指数：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；糖水消耗实验：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；敞箱得分：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；大鼠活动延长时间：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组。组内比较行为学指标、高、中、低剂量组与时间呈正相关，空白组与对照组与治疗时间无差异。脑组织HE染色后，显微镜拍照观察脑组织的病理改变（Figure）。结果显示，模型组大鼠海马CA1区锥体细胞偶见散在的胞体固缩，深染或胞质溶解、空泡变性。CA4区可见少量锥体细胞胞体固缩，深染。治疗组大鼠海马区神经元排列整齐，细胞体呈椎体形，较大，核大而圆，且与中药剂量呈正相关。

3.讨论

抑郁症患者常伴有一些生物性节律改变，如睡眠障碍、食欲不振、便秘、身体乏力、精力减退、性功能障碍等，这些生理症状应用西药抗抑郁药很难解决，甚至一些西药还会加重上述障碍，在上市销售明确用于抑郁症治疗的天然药物及中药复方制剂中，不是治疗单一，就是疗效不显著，而且用药一段时间极易出现病情反复的现象，同时症状更加严重。传统中药在复杂的抗抑郁治疗方面具有明显的优势，很多研究都表明祖国传统的经方名方对于抑郁症的治疗能够达到很好的疗效[3]。研究发现，柴胡加龙骨牡蛎汤复方具有较强的抗焦虑、抗抑郁作用，其作用机制可能与增加了脑内单胺类神经递质的含量密切相关[4]。宁神灵冲剂由二组药组成，一组舒肝郁、平肝火、清痰热，另一组扶心阳固心气。收敛神气之浮越，合之调节心、肝二脏之功能，使之趋于平衡，神志之病，脏腑辨证在于此二脏，二脏平和，消除各种精神神经症状。与西药作用迥然不同，它针对神经抑制和兴奋过程失调而组方，通过双向调节大脑皮层兴奋和抑制神经的过程，消除焦虑、不安、烦躁，以达到镇定的良好效果，具有中药复方的双向调节作用。在中枢神经系统中，海马是与学习、记忆和情绪行为功能密切相关的重要脑区，也是应激易累及损伤的主要靶区[5]。以往的研究发现，长期电击足底可致大鼠海马神经元损伤和大量丢失[6]。本研究采用慢性不可预测的应激建立的抑郁模型大鼠也发现海马神经元大量丢失，同时海马突触体内游离钙浓度显著增高。海马环路的主要神经递质为Glu，海马（特别是CA3区）锥体细胞含有丰富的N-甲基-D-天冬氨基酸（NMDA）受体。严进等报道，慢性应激可导致海马兴奋性氨基酸含量显著增高[7]。过量的Glu作用于NMDA受体，而NMDA受体为非选择性阳离子通道，过度开放引起大量Ca2+内流，结果导致胞内Ca2+浓度异常增高，造成细胞内Ca2+超载。胞内高Ca2+可激活内源性酶，产生大量的自由基毒害细胞，引起细胞坏死，也可导致DNA链的断裂，引发细胞凋亡。细胞坏死或凋亡的最终结果是海马神经元大量丢失，海马容积变小。目前抑郁症的治疗主要是针对神经递质的紊乱，采用单纯的抗抑郁治疗。如果同时在预防神经元损伤方面予以辅助药治疗，则为今后临床预防甚至治疗慢性应激引起的抑郁症开辟了新的途径。在应激状态下海马的神经生成减少，而舒适的环境、适当的锻炼及抗抑郁药治疗可促进海马的神经生成。本实验通过研究宁神灵干预后抑郁症大鼠的行为学改变及其海马神经元细胞的病理学改变得出，宁神灵可能通过作用于大鼠海马神经元细胞，引起相关蛋白及递质的改变，具有抗抑郁作用。

【参考文献】

[1]ChoeCJ,EmslieGJ,MayesTL.Depression[J].ChildAdolescPsychiatrClinNAm,2012,21(4):807-829

[2]汪崇泽,盛国红.免疫炎症途径与抑郁症的研究进展[J].精神医学杂志,2015,28（5）:397-400.

[3]王建婷,王上;刘松林;王彦春;李家庚;陈雨.基于整合药理学平台的柴胡-黄芩药对抗抑郁的分子机制研究[J].中国中药杂志,2018（7）:1323.

[4]何荣荣,夏宝妹,刘珺;周业娣.柴胡加龙骨牡蛎汤加减方治疗产后抑郁30例疗效观察[J].湖南中医杂志,2017,33(8):79-81.

[5]Stein-BehrensBA,SapolskyRM.Stressaxacebatesneu-ronlossandcytoskeletalpathologyinthehippocampus[J].JNeurosci,1997,14:5373

[6]ZhangYM,YangQ,XuC.Effectsofphenytoinonmor-phologyandstructureofhippocampalCA3pyramidalneuronsofratsinchronicstress[J].ActaPharmacolSin,2003,24:403.

[7]严进,王春安,陈宜张,等.应激对大鼠行为和部分脑区谷氨酸含量的影响[J].心理学报,1995,27:422.