胶乳散射免疫比浊法检测脂蛋白磷脂酶A2方法学评价

张晨

【摘要】目的：对胶乳散射免疫比浊法测定脂蛋白磷脂酶A2（Lp-PLA2）进行方法学评价。方法：按照美国临床和实验室标准协会标准，对Lp-PLA2进行干扰实验，对准确度、最低检测限、线性、重复性、批间差等5项进行性能验证。结果：检测线性范围为100～480ng/ml，最低检测限＜78ng/ml，比对试验相关系数r＞0.98，相对偏差＜18%；干扰试验中胆红素＞0.1/L、血红蛋白＞1.2g/L、脂血＞1.0g/L对结果无影响；批内重复性CV＜7.5%，批间差CV＜11.2%。结论：乳胶散射免疫比浊法定量测定人血清或血浆中脂蛋白磷脂酶符合检测系统规定的要求，满足临床检测需求。

【关键词】脂蛋白磷脂酶A2；乳胶散射免疫比浊法；方法学评价

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）10-0095-01

脂蛋白相关性磷脂酶A2是磷脂酶A2超家族的成员。循环中的脂蛋白相关性磷脂酶A2（Lp-PLA2）是一种主要由巨噬细胞产生的反映血管炎症的特异性标记物，在低密度脂蛋白的氧﹑促进动脉粥样硬化以及冠心病和卒中的形成等方面发挥重要作用[1]。脂蛋白相关性磷脂酶A2水平升高是预测冠心病和卒中风险的一种独立危险因子。因此近年来相关研究不断，为了常规开展Lp-PLA2检测，最大程度地应用于临床，我们参考美国临床和实验室标准协会（CLSI）的相关文件[2]，对乳胶散射免疫比浊法检测Lp-PLA2进行临床应用前方法学评价与验证，以期待选择符合标准的试剂和方法能应用于临床[3]。

1.对象和方法

1.1检测对象

本院住院人群及正常体检人群血清。

1.2仪器

NORMAN系列散射比浊分析仪（NORMAN-1）、NRM411全自动化学发光定量分析仪。

1.3试剂

NORMAN脂蛋白相关性磷脂酶A2试剂盒（乳胶散射免疫比浊法）。其中R1:200mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH7.5～9.0）﹑0.5%聚乙二醇600。R2:200mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.5～9.0﹑1.9g/L胶乳和0.095g/L脂蛋白磷脂酶A2（Lp-PLA2）抗体。质控品、校准品为南京诺尔曼惠赠。

1.4样本采集与处理

血清用普通血清管﹑快速血清管或惰性分离胶促凝管收集。血浆用肝素钠抗凝。样本采集后应立即使用，若不能立即使用则2～8℃保存，在12小时内完成检测，血清样本在-20℃保存稳定一个月内使用。待测的样本中不能出现沉淀，如有沉淀出现，必须先做离心处理。加热灭活样本﹑溶血样本都应弃用。检测前样本必须恢复至室温。冷冻保存的样本需完全融化﹑复温﹑混合均匀后方可使用。血清样本切记反复冻融，血浆样本应避免冷冻。

1.5检测方法

a、散射比浊法是按照试剂盒操作。加试剂R1240ul于样品反应杯中，然后加入血清和血浆12ul,混匀，等反应杯中的散射光强度稳定后，加入试剂R260ul混匀，在一分钟之内，测定散射光强度的变化率。同时对两个水平的质控品进行测定。b、化学发光法检测是外送样本至南京诺尔曼公司检测。

1.6统计学处理

采用SPSS16.0统计分析软件。正态分布的计量资料以表示，组间含量比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。非正态分布计量资料以中位数[M(P25，P75)]表示，组间及两两比较采用非参数秩和检验。评价线性和相关性时，用相关与回归分析。符合双变量正态分布的资料选用Spearman秩相关。偏倚分析采用Bland-Altman方法，以两比较方法的均值作为X轴，差值作为Y轴。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1选用同一家厂家化学发光法进行比对测量，使用浓度在50ng/ml～800ng/ml间12个不同浓度血清样本进行测定比对，检测线性范围为100～480ng/ml，相关系数r＞0.98，相对偏差＜18%，最低检测限＜89.2ng/ml。

2.2干扰试验

是在待测血清中加入一定量的胆红素、血红蛋白、或乳糜血中，在Lp-PLA2浓度为150ng/ml是使得胆红素浓度＞0.1g/L、血红蛋白＞1.2g/L、脂血（甘油三酯）＞1.0g/L测定。记录结果，显示三种浓度下，结果偏差分别为8ng/ml、9ng/ml、12ng/ml，计算偏差均小于8%。

1.3选择20份浓度在100～480ng/ml的不同样本，用同一批次试剂进行重复测定，计算变异系数，最高CV＜7.5%，最低CV＜2.3%。用不同批次试剂进行重复测定，每月完成1批检测，实验在6个月之内完成，合计6次。计算检测值变异系数，批间差最高CV＜9.2%，最低CV＜2.8%。

3.讨论

脂蛋白磷脂酶A2是临床实验室近期开展较多的项目，但方法学往往集中在酶联免疫吸附试验（ELISA）或胶乳凝集法，但方法学有一定缺陷，如时间长、定量结果不准确等[4]。乳胶散射免疫比浊法定量可广泛应用于生化分析仪，具有方便快捷、准确等特点，因此收到临床实验室人员的青睐。

由结果2.1显示该方法检测具有较好的相关性。表明与试剂盒表明相符。结果2.1与结果2.3显示：乳胶散射免疫比浊法线性范围与ELISA相当，但重复性较文献报道为好[5]。结果2.2显示，干扰试验与ELISA和胶乳凝集无统计学差异，偏差能够满足临床需求。有结果2.3显示，相关偏差最大小于7.5%和9.2%，小于试剂规定的8%和12%，满足临床需求。方法学检测线性范围较荧光法或化学发光法为窄，超出部分需要稀释检测，为该方法不足之处。[6]

综上所述，使用脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒定量测定人血清或血浆中脂蛋白磷脂酶A2（Lp-PLA2）含量的乳胶散射免疫比浊法正确度﹑灵敏度较高，可重复性及稳定性好，操作简单快速。相应的方法学参数符合试剂盒规定的标准和要求，能够满足临床需求。

【参考文献】

[1]赵洁，吴俊，贾玫.冠心病患者血液脂蛋白相关磷脂酶A2与超敏C反应蛋白及D一二聚体的相关性研究[J].中华检验医学杂志，2014，37(3):227-229.

[2]CLSI.Evaluationofprecisionofquantitativemeasurementprocedures;approvedguideline-thirdedition(EP05-A3)[S].2014．

[3]张秀明，范勇利，温冬梅，等.临床化学自建检测系统性能确认的精密度与正确度及准确度的研究[J].中华检验医学杂志，2016，39(9):713-715.

[4]贾珂珂，秦雁飞，杨硕，等.脂蛋白（a）颗粒浓度测定方法与2种脂蛋白（a）质量浓度测定方法的比较及临床应用评价[J].检验医学，2017，32(7):570-576.

[5]李妍，曾欧，李琳，等.冠心病患者血清CysC、Lp-PLA2、MMP-9、PAI-1水平变化及临床意义[J].山东医药，2016，56(33):5-7.

[6]谢海涛，汤永平，解巧丽，等.脂蛋白相关磷脂酶A2免疫荧光层析法的建立及临床应用[J].中南医学科学杂志，2017，45(9):523-527.