HPLC法测定九华痔疮栓中大黄素和大黄酚的含量

吴良发1*吴毅1周敏2

【中图分类号】R574.8【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）06-0165-02

【摘要】目的建立HPLC法测定九华痔疮栓中大黄素和大黄酚的含量。方法采用WondasilC18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；以甲醇-0.1%磷酸溶液（70:30）为流动相；流速1.0mL•min-1；检测波长254nm；柱温30℃。结果大黄素在0.008288～0.24864μg范围内呈良好的线性关系(r=0.99999)，平均回收率(n=6)为99.6%；大黄酚在0.0218～0.654μg范围内呈良好的线性关系(r=0.99998)，平均回收率(n=6)为95.4%。结论该方法简便、准确，重复性好，可作为九华痔疮栓的质量控制方法。

【关键词】HPLC法九华痔疮栓大黄素大黄酚

九华痔疮栓由大黄、浙贝母、侧柏叶（炒）、厚朴、白及、冰片、紫草7味中药材组成，具有消肿化瘀、生肌止血、清热止痛之功效。大黄是君药，其主要的活性成分是蒽醌类成分，其中大黄素、大黄酚在植物中含量较高[1]。但九华痔疮栓现行标准[2]未对大黄素和大黄酚进行定量控制，为了进一步完善九华痔疮栓的质量标准，本文参考有关文献[3～5]开展了本项研究。结果表明该法简便、准确、重现性好，可作为该品种的质量控制方法，尚未见文献报道。

1仪器与试药

Agilent1100高效液相色谱仪，可变波长紫外检测器。

大黄素对照品（批号:110756-200110，中国药品生物制品检定所，含量测定用），大黄酚对照品（批号:110796-200716，中国药品生物制品检定所，含量测定用），甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

2溶液制备

2.1对照品溶液精密称取大黄素、大黄酚对照品适量，加甲醇制成每1ml含大黄素3μg、大黄酚6μg的混合溶液，即得。

2.2供试品溶液取重量差异项下的本品，研碎，混匀，取约2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置烧瓶中，蒸干，残渣加8%盐酸溶液20ml，超声使溶解，再加三氯甲烷20ml，加热回流1小时，取出，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷液，酸液再用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇微热使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3阴性样品溶液取缺大黄阴性样品，按照供试品溶液制备方法制备,即得。

3色谱条件

色谱柱:WondasilC18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液（70:30）；流速:1.0mL•min-1；柱温:30℃；检测波长254nm；进样量20μL。在上述色谱条件下，对照品、样品及阴性样品色谱图见图1。

图1大黄素对照品(A)、大黄酚对照品(B)、样品(C)、阴性样品(D)色谱图

4线性范围

精密称取大黄素对照品10.36mg、大黄酚对照品27.25mg，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；精密吸取0.1、0.5、1、2、3mL，分别置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别取20μL，注入高液相色谱仪，测定，以对照品进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归分析，大黄素回归方程为:Y=3762.26050X-0.55732，r=0.99999；大黄酚回归方程为:Y=4244.29995x-0.41975，r=0.99998。

结果表明大黄素在0.008288～0.24864μg之间呈良好的线性关系；大黄酚在0.0218～0.654μg之间呈良好的线性关系。

5精密度试验

精密吸取上述对照品溶液20μL，按上述色谱条件连续进样6次，测定峰面积，结果大黄素RSD为0.4%，大黄酚RSD为0.3%，表明仪器精密度良好。

6稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液20μL，分别在0，6，12，18，24h各进样2次，以峰面积平均值计算，结果大黄素RSD为0.4%，大黄酚RSD为0.7%，表明供试品溶液在24h内基本稳定。

7重复性试验

按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，分别精密吸取20μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进样测定，结果大黄素含量平均值为35.95μg•g-1，RSD为2.0%；大黄酚含量平均值为65.20μg•g-1，RSD为2.1%。

8加样回收率试验

取已知含量的样品，研细，取1g共6份，精密称定，分别精密加入大黄素（1.244μg•mL-1）和大黄酚（2.18μg•mL-1）混合对照品甲醇溶液25ml，按“2.2”项下方法制备所需溶液，分别精密吸取20μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，结果大黄素平均回收率(n=6)为99.6%，RSD=2.2%；大黄酚平均回收率(n=6)为95.4%，RSD=2.3%。

9样品测定

按上述供试品溶液的制备方法和测定条件，测定9批样品中大黄素和大黄酚的含量，采用外标法计算。结果上述9批样品中每粒含大黄素和大黄酚的总量分别为0.17，0.15，0.23，0.21，0.19，0.18，0.21，0.13，0.20mg。

10讨论

10.1提取方法的选择曾比较不同的提取方式、不同溶剂种类、不同提取时间、不同酸水解时间，对目标成分的含量影响。结果表明采用甲醇25mL加热回流1h，酸水解1h含量可达最高，故采用本文所述的方法。

10.2检测波长的选择将大黄素、大黄酚对照品用甲醇分别制成溶液，在400～200nm波长范围内进行光谱扫描，结果大黄素在252.5nm、大黄酚在255.5nm波长处有最大吸收，并参考中国药典2010年版一部大黄[3]的检测波长，确定检测波长为254nm。

10.3流动相的选择文献报道[3～5]多用甲醇与0.1%磷酸溶液作为流动相，本文对两者的比例进行了摸索，发现比例为70:30时，大黄素和大黄酚峰保留时间适中，峰形和分离均较好，故确定流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（70:30）。

参考文献

[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社，1985:102.

[2]国家药典委员会.卫生部药品标准中药成方制剂第十八册[M].北京:化学工业出版社,1998:10.

[3]国家药典委员会.中国药典（一部）[M].北京:中国医药科技出版社,2010:22.

[4]曹健,王芳,雷健,等.反相高效液相色谱法测定延肾胶囊中大黄素和大黄酚的含量[J].中国医院用药评价与分析,2010,10(2):148.

[5]徐晶,田原,康廷国.HPLC法测定皮肤病血毒丸中大黄素及大黄酚含量[J].中药材，2008,31(8):1255.