摘要：三氟乙酸（TFA）是多肽药物的一项重要控制项目，目前报道较多的检测方法是离子色谱法（IC）与高效液相色谱法（HPLC）。本文分别对IC及HPLC法进行研究：结果表明IC法TFA定量限为2.4ng，推算检出限为0.8ng，且在0.12088μg/mL～6.044μg/mL范围内呈良好的线性关系（r=0.9999）；HPLC法定量限为6ng，检出限为1.5ng，且在0.3023μg/mL～15.115μg/mL范围内呈良好的线性关系（r=0.9998），加标回收率为99.3%～101.7%，精密度（n=6）为0.192%～0.200%，RSD5=1.4%。结论：IC法与HPLC法相比，在灵敏度，线性及重复性等方面差异不大，均能满足准确检测相关多肽样品中TFA含量要求，但HPLC法适用范围更广，且能同时检测多肽药物中醋酸（HAC）及三氟醋酸（TFA）含量，达到简单易行、结果准确、灵敏度高、降低成本、提高效率的研究目的。关键词：离子色谱法，高效液相色谱法，多肽，三氟乙酸，含量检测中图分类号：文献标识码：AAbstract：Trifluoroaceticacid(TFA)isanimportantcontrolitemofpolypeptidedrugs.Ionchromatography(IC)andhighperformanceliquidchromatography(HPLC)arecommonlyusedinthedetectionofTFA.Inthispaper,ICandHPLCmethodsarestudiedrespectively.TheresultsshowedthatthequantitativelimitofTFAbyICmethodwas2.4ng,thedetectionlimitwas0.8ng,andthelinearrelationshipwasgoodintherangeof0.12088ug/mLto6.044ug/mL(r=0.9999);thequantitativelimitofHPLCwas6ng,thedetectionlimitwas1.5ng,andthelinearrelationshipwasgoodintherangeof0.3023ug/mLto15.115ug/mL(r=0.9998).Therecoverywas99.3%~101.7%,theprecision(n=6)was0.192%~0.200%,RSD5=1.4%.CONCLUSION:ComparedwithHPLC,ICmethodhaslittledifferenceinsensitivity,linearityandrepeatability,andcanmeettherequirementofaccuratedeterminationofTFAcontentinrelatedpolypeptidesamples.However,HPLCmethodhasawiderapplicationrangeandcansimultaneouslydetectthecontentsofHACandTFAinpolypeptidedrugs.TheHPLCmethodissimple,accurate,sensitive,lowcostandefficient.Keywords：Ionchromatography;HPLC;Peptide;Trifluoroaceticacid;Contentdetermination1前言三氟乙酸（TFA）普遍用于合成多肽的工艺中作为切割剂及脱保护剂，临床使用存在毒性。目前中国药典将其纳入需控制的溶残，归为四类溶剂，但对其控制限度尚无明确规定，通常按三类溶剂的限度0.5%限定。多肽药物固相合成中，对于合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。保护基的选择既要保证侧链基团不参与形成酰胺的反应，又要保证在肽合成过程中不受破坏，同时又要保证在最后肽链裂解时能被除去。因使用TFA将肽链从树脂上切下的同时能对R侧链的保护基进行脱保护，且不同侧链对应的不同保护基，基本都能用TFA进行去保护，故目前几乎所有固相合成工艺均会在工艺中使用TFA。同时由于TFA与多肽的结合很稳定，冻干或旋蒸步骤都无法将其完全去除，故需对固相工艺合成的多肽药物进行检测及控制。因此，TFA含量测定是合成多肽药物的一项重要检测项目。对比已有文献中TFA不同的检测方法，根据品种实际情况来选择合适的方法，达到简单易行、结果准确、灵敏度高、降低成本的要求，是本次研究的主要目的。2三氟乙酸检测方法概述TFA检测方法，包括气相色谱法[1]、气相色谱-质谱法[2]、高效液相色谱法[3-4]、毛细管电泳法[5]以及离子色谱法[6-9]等。总结相关资料，目前发表的文献中，较多采用的是离子色谱法及高效液相色谱法。从文献总结的研究结果来看，离子色谱法与高效液相色谱法均具有较高的灵敏度，线性，回收率，重复性等也符合要求。故本次研究主要考察离子色谱法及高效液相色谱法。2.1离子色谱法概述相关文献中离子色谱检测法大同小异，均采用采用离子色谱仪；使用阴离子交换柱以及离子抑制器；流速基本在0.7mL/min～1.3mL/min范围内（根据其不同品种特性选择）。各文献中最大的差异在于淋洗液的选择，淋洗液主要分为两种：一种是以氢氧化钠（NaOH）或氢氧化钾（KOH）水溶液溶液为淋洗液；另一种是以碳酸钠（Na2CO3）/碳酸氢钠（NaHCO3）混合溶液作为淋洗液进行检测。检测方法中，还考虑了淋洗液浓度及PH，流速，柱温等对检测结果的影响[10]。2.2高效液相色谱法概述高效液相色谱法均采用高效液相色谱仪，普通C18柱，流速均为1.0mL/min，柱温30℃～35℃，流动相均为0.07%～0.08%磷酸溶液-甲醇混合液。3IC法与HPLC法对比研究3.1对IC研究仪器与试剂离子色谱仪为Metrohm883BasicICPlus（瑞士万通，配离子抑制器）；色谱柱为MetrosepASupp5-250/4.0阴离子分析柱（瑞士万通）；电子天平为AnalyticalBalancesML204T/00及MS105（METTLERTOLEDO公司）等。三氟乙酸钠：基准试剂，Sigma-Aldrich，含量≥99.0%；氢氧化钠：AR，成都金ft化学试剂，含量≥96.0%。色谱条件淋洗液为10mmol/l氢氧化钠溶液；流速0.7mL/min；进样量20μl；柱温30℃；色谱柱为MetrosepASupp5-250/4.0阴离子分析柱。方法研究在对该方法考察过程中，首先进行了淋洗液的对比，分别以NaHCO3（1.0mmol/l）+Na2CO3（3.2mmol/l）的混合溶液作为淋洗液（淋洗液1）及以10mmol/l氢氧化钠溶液作为淋洗液（淋洗液2），考察图谱情况。结果发现淋洗液1进行检测时，目标峰三氟乙酸出峰处有杂质峰干扰，且该杂质的出现无规律，导致目标峰无法准确积分；而使用淋洗液2，目标峰处无干扰，且进行流速变化，淋洗液浓度变化等考察发现，除目标峰保留时间有变化，其响应值及最终计结果基本一致。最终选择淋洗液2进行研究，并根据保留时间、色谱柱承受能力及系统压力选择适宜的浓度及流速。后进行检测限、定量限及线性考察，也均符合要求。考察数据见下表1及表2：表1TFA定量限重复性考察（IC）Table1RepeatabilityofTFAquantitationlimit(IC)重复性/针123456峰面积RSD%0.00570.00570.00570.7%0.00570.00570.0058表2TFA线性考察（IC）Table2TFAlinearity(IC)TFA浓度μg/mL0.120880.181320.377750.75551.5113.0226.044TFA峰面积0.00570.00870.020.0390.0790.1680.329线性方程y=0.0548x-0.0013r=0.9999总结：因检测限无法根据信噪比准确计算，故根据线性推算其能准确检测的最低浓度。根据结果可知离子色谱法检测TFA，定量限为0.12088μg/mL；且在0.12088μg/mL～6.044μg/mL范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系，y=0.0548x-0.0013，r=0.9999。3.2高效液相色谱法研究仪器与试剂高效液相色谱仪为岛津SPD-20AT；色谱柱为WelchUltimateAQ-C18,250*4.6mm5um；电子天平为AnalyticalBalancesML204T/00及MS105（METTLERTOLEDO公司）,PH计为FE20（METTLERTOLEDO公司）等。三氟乙酸钠：基准试剂，Sigma-Aldrich，含量≥99.0%；磷酸：分析纯（AR），成都金ft化学试剂，含量≥85.0%；甲醇：色谱纯（HPLC），SKChemicalSkyStltech，纯度≥99.99%；氢氧化钠：AR，成都金ft化学试剂，含量≥96.0%。色谱条件以磷酸溶液（在1000mL水中加磷酸0.7mL，用0.42%氢氧化钠溶液调节pH值至3.0)-甲醇（95:5）为流动相；流速为1.0mL/min；检测波长为210mn，柱温为30℃。方法研究各文献中高效液相色谱法基本一致。中国药典四部通则0872合成多肽中醋酸测定法，与文献中各方法也基本一致，且该方法可检出多肽样品中醋酸含量，若同时能将三氟乙酸准确检出，可使检验操作更简单，节省成本，提高效率。HPLC方法研究中，先进行TFA定性考察，确定TFA保留时间为5min（见下图1）。且HAC峰与TFA峰分离度良好，TFA出峰处无其他杂质及空白溶剂干扰，系统适用性良好。图1TFA定位图2TFA定量限重复性Fig.1TFApositioningFig.2RepeatabilityofTFAquantitationlimit检测限及定量限研究检测限：精密称取三氟乙酸钠对照品适量，用流动相溶解并稀释至0.1511μg/mL，进行测定，测得信噪比为3。定量限：精密称取三氟乙酸钠对照品适量，用流动相溶解并稀释至1.0077μg/mL，进行测定，测得信噪比为13。对定量限进行重复性考察，记录色谱图（见上图2），结果见下表表3TFA定量限重复性考察（HPLC）Table3RepeatabilityofTFAquantitationlimit(HPLC)线性考察取三氟乙酸对照品适量，精密称定，加流动相溶解并分别稀释制成0.3、1.0、3.0、5.0、8.0、10.0、12.5、15.0μg/mL的溶液，依次进样20μl，记录色谱图（见下图3）。以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X,g/mL)为横坐标，进行线性回归。回归方程：Y=467.53x-26.4，r=0.9998（见下图4），线性范围为0.3023～15.115μg/mL。结果见下表4：表4TFA线性考察（HPLC）Table4TFAlinearity(HPLC)C（μg/mL）0.30231.00773.0235.0388.06110.07712.59615.115RT/min5.0935.0895.0865.0835.0815.0765.0755.071A线性方程15648113612480Y=467.53x-26.43673r=0.9998472759177028图3TFA线性图谱（HPLC）Fig.3TFAlinearmap(HPLC)图4TFA线性图及方程（HPLC）Fig.4TFAlineargraphandequation(HPLC)回收率及精密度考察配制0.5mg/mL供试品溶液，含TFA约0.02%，即浓度为1μg/mL。以10μg/mL为100%浓度，分别配制80%，100%，120%浓度的对照品溶液各三份，分别称取供试品约50mg，共9份平行样，用配制的80%，100%，120%浓度的对照品溶液溶解并稀释至10mL（每个浓度3份），即得目标溶液。按要求进样，结果见下表5。分别精密称取适量供试品5份，配制成0.5mg/mL供试品溶液，按要求进样，考察样品精密度。结果见下表6。表5TFA回收率（HPLC）Table5TFArecovery(HPLC)加标量对照浓度测得峰面积供试峰面积测得浓度回收率平均值（μg/mL）（μg/mL）42164428.129100.84%80%8.06142844818.190101.60%101.70%43334918.274102.64%526247410.297102.18%100%10.077513543510.110100.33%100.66%512746710.02399.46%625043912.48599.12%120%12.596630644912.58399.90%99.26%623944812.44298.78%表6TFA精密度考察（HPLC）Table6TFAprecision(HPLC)平行样样1样2样3样4样5样6TFA峰面积445445484471418463TFA含量%RSD%0.1960.1960.2001.4%0.1980.1920.1974总结通过对比考察IC法与HPLC法对TFA的检测，得出以下结论：（1）检出限及定量限对比：根据研究结果可计算出IC法的定量限为2.4ng，推算检出限为0.8ng左右。HPLC法的定量限为20ng（按S/N计算），检出限为1.5ng（按S/N计算）。但根据线性数据，可判断能准确检测的最低浓度为0.3023ug/mL，即定量限为6ng。总体来说，在灵敏度方面IC法与HPLC法相差不大，均能满足目前几个多肽药物的检测要求。（2）适用范围对比：IC法流动相体系一般使用水相系统，遇到难溶于水相的多肽品种，则可能因溶解度问题导致检测不准确，或必须增加样品前处理步骤（如萃取等）[11]，费时费力且无法完全保证准确度；而HPLC法无论水相系统或有机相系统均可用，对难溶于水相系统的多肽药物来说更适用。从这方面来看，HPLC法适用范围更广。（3）简单易行，检测成本对比：目前大部分多肽品种，均需要控制HAC含量，且一般用HPLC法进行控制。若TFA也采用HPLC法进行检测，则能同时检测出样品中HAC与TFA的含量，节约成本，提高效率。HPLC法用来进行HAC检测，已通过方法学验证；该方法进行TFA检测，根据本文中定量限，检测限，回收率与重复性等考察结果可判定，适合于目前几种多肽药物的检测。HPLC法适用范围更广，且能同时检测多肽药物中醋酸（HAC）及三氟醋酸（TFA）含量，达到简单易行、结果准确、灵敏度高、降低成本、提高效率的研究目的。参考文献[1]ThomasM．Cahill，JodyA．Benesch，MaeS．Gustin，etal．Simplifiedmethodfortraceanalysisoftrifluoroaceticacidinplant，soil，andwatersamplesusingheadspacegaschromatography．AnalChem，1999，71:4465[2]项徐伟,沈志群,郑刚,吴鹏.气相色谱-质谱法测定水体中三氟乙酸[J].理化检验2010,（3）.[3]杨小明,赵冬梅.高效液相色谱法测定比伐卢定中三氟乙酸含量[J].中国Th化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics201031（2）：126-127.[4]于伟,隽海龙.高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸残留[J].中国实用医药(ChinaPracMed),2013,8（36）：13-14.[5]KanthiHettiarachchi，ShaneRidge．Capillaryelectrophoreticdeterminationofaceticacidandtrifluoroaceticacidinsyntheticpeptidesamples.JChromatogrA，1998，817(1－2):153[6]FangWang，GregW．Dicinoski，YanZhu，etal.Simultaneousdeterminationofmonofluoroacetate，difluoroacetateandtrifluoroacetateinenvironmentalsamplesbyionchromatography．JChromatogrA，2004，1032(1－2):31.[7]陈磊,马明扬.合成多肽药物中三氟乙酸残留物分析[C].第十二届全国离子色谱学术报告会论文集.福建,2008.11.5-8,375-377.[8]冯顺卿,李咏华.离子色谱法测定酒石酸长春瑞滨中三氟乙酸残留[J].药物分析杂志(ChinJPharmAnal)2013，33(2):289-291.[9]郭兴辉,黄永丽.淋洗液在线发Th_离子色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸残留[J].药物分析杂志(ChinJPharmAnal)2014，34(6):1077-1079.[10]敖雪桔.离子色谱分析中淋洗液条件选择的探讨[J].黑龙江环境通报(HeilongjiangEnvironmentalJournal)2009,33(3)33:27-29.[11]周长朋,王东武.离子色谱/直接电导法测定利格列汀药物中三氟乙酸残留[J].分析测试学报2015,34(12):1425-1429.
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