月见草油抑制巨噬细胞炎症因子的作用研究

张红军1鲁永霞2马会明3（通讯作者）

3宁夏医科大学生育力保持建教育部重点实验室宁夏银川750004

【摘要】探讨月见草油对巨噬细胞释放的炎症因子的抑制作用。结果显示月见草油对小鼠巨噬细胞的形态有显著性的改变，抑制脂多糖诱导后释放的炎症因子，RT-PCR结果表明月见草油显著性抑制了环氧合酶-2的表达（p＜0.05），降低了PGE2的表达水平；ELISA结果表明月见草油显著性地抑制和剂量依赖性地减少了一氧化氮合酶（iNOS）和肿瘤坏死因子（TNF-a）减少，白介素-1β（IL-1β）的产生（p＜0.05）。结果表明月见草油在炎症反应中扮演了保护作用，月见草油是一种功能性治疗药物。

前言

月见草油是从月见草（晚樱草）种子中提炼出来的油脂，其含有丰富的多聚不饱和必需脂肪酸，主要成分为γ-次亚麻油酸，已经报道其中ω-6系列必须脂肪酸具有多项治疗作用，对心血管疾病，经前症候群，更年期综合征和糖尿病神经病变等具有疗效（1）。研究报道一氧一氧化氮在炎症反应和免疫反应中扮演重要的作用，巨噬细胞又是常见的一氧化氮合成的主要细胞来源，因此通过脂多糖诱导巨噬细胞iNOS合成，而且巨噬细胞能够产生TNF-a，IL-1β因子，巨噬细胞激活也可以产生环氧合酶，和前列腺E2（PGE2），这些因子在炎症反应的病理过程中具有重要的作用（2），本研究鉴于月见草对巨噬细胞产生的炎症反应报道较少，利用提取的月见草油研究对TNF-a，IL-1β因子和环氧合酶的影响，

1材料和方法

1.1材料和试剂

月见草油购自美国公司，含量为，按照比例贮存液溶解在DMSO中，工作液溶解在细胞培养液中.trizonl试剂和RPMI1640培养基购自life-tech公司，鼠iNOS合酶，鼠IL-1β，鼠TNF-a因子ELISA试剂盒均购自博士德生物公司，western试剂购自Cox-2抗体和PGE2抗体购自博奥森生物公司。

1.2巨噬细胞培养及处理

按照实验室常规方法，解冻巨噬细胞RAW264.7，用RPMI1640基础培养基补充10%胎牛血清（FΒS），100iu请链霉素，以1x106个/ml密度接种，在培养箱24孔板中生长过夜，次日换新鲜培养基（5%FΒS）含有浓度为5ug/ml的LPS，同时添加不同浓度月见草油，实验分为高浓度组（200ug/ml），中浓度组（100ug/ml），低浓度组（50ug/ml）和空白对照组。

1.3细胞增殖活力WST法检测

按照文献（4）常规试验方法用WST的方法评价月见草油对LPS诱导的炎症反应的效果。

1.4ELISA法测量一氧化氮TNF-a减少，白介素-1β的产生

按照文献（2）常规方法分别取100ul的处理后的细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒的操作规程检测iNOS，TNF-a和IL-1β的吸光度值，利用说明书中标准溶液制备标准曲线，计算出各个处理对应的浓度。

1.5RT-PCR检测PGE2和COX-2mRNA表达

按照文献（5）常规方法对各组处理的RAW264.7细胞经过Trizonl试剂提取总RNA，经过逆转录和PCR反应，PCR特异性引物分别是：PGE2基因的上游引物5′-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3′，下游引物5′-CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3′；COX-2基因的上游引物5′-CACTACATCCTGACCCACTT-3′，下游引物5′-ATGCTCCTGCTTGAGTATGT-3ˊ；β-actin基因的上游引物5′-GTGGGCCGCCCTAGGCACCAG-3′，下游引物5′-GGAGGAAGAGGATGCGGCAGT-3′。PCR反应条件为95℃7min，94℃45s，60-65℃30s，72℃1min，72℃10min，4℃forever，30个循环。经1.2%琼脂糖凝胶电泳和EΒ染色分析PGE2和cox-2mRNA表达

1.6统计方法

实验数据以均数±标准差（±SD）表示。并应用SPSS17统计软件系统以T检验及单因素方差分析进行统计分析。检验标准采用P=0.05。

2结果

不同处理组月见草油对巨噬细胞生长情况的影响

巨噬细胞RAW264.7经过LPS单独诱导后细胞形态固缩，单个细胞变圆，当使用月见草油进行保护时，细胞形态显著性改变，随月见草浓度的增加，细胞形态逐渐趋于正常，表明月见草油对产生炎症反应有显著性保护作用。

图

2月见草油对PGE2和COX-2mRNA表达的影响

2.3不同处理组月见草油对炎症因子分泌的影响

如图3所示，ELISA检测结果显示巨噬细胞经过LPS和各种浓度的月见草油处理后炎症因子的分泌显著性变化，与对照组相比LPS显著性诱导iNOS、TNF-a和IL-1β的分泌（p＜0.05）；高浓度组（200ug/ml），中浓度组（100ug/ml）和低浓度组（50ug/ml）的月见草油处理后iNOS、TNF-a和IL-1β的分泌水平显著性下降（p＜0.05）。

图3月见草油对iNOS、TNF-a和IL-1β分泌水平的影响

3讨论

月见草原名晚樱草，被誉为生命之花；在欧洲被称之为“皇室御药”或“国王药物”。月见草油是从月见草种子中提取的天然产物，已报道产物主要成分为γ-次亚麻油酸，其中还含有丰富的镁，锌，铜、维生素C、E、Β6、Β5等微量元素和维生素，不同于常见的普通植物油、大豆油、葵花油中所含的ω-6亚麻油酸，文献报道在抗炎，抗菌和降低胆固醇和抗癌治疗中有一定作用（1）。因此在体内扮演着许多重要的角色。服用后可以治疗心血管疾病，经前症候群，更年期综合症等多种疾病。γ-次亚麻油酸在体内会产生一种前列腺素E1（PGE1），PGE1又会产生PGE2的生理作用，对炎症有明显的改善作用（3）。本研究证实在LPS诱导作用下，产生大量的TNF-a，IL-1β和iNOS等因子，当用不同浓度月见草油处理后，这些炎症因子显著性降低。

月见草油抑制炎症的作用机理至今不能确定，但是，一些重要的因子已经在不同的研究中鲜有报道，本研究中检测月见草油对PGE2和COX-2的表达，结果证明月见草油显著性抑制其表达，究其原因，月见草油可能抑制了NF-KΒ通路的活性（2）。鉴于月见草油的显著性抗炎作用，下一步研究将分离提纯月见草油的活性成分，用于抗炎，抗癌等的治疗中

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