小分子BH3模拟物S1的抗肿瘤分子药理机制研究

彭云滔于兰王俊锋张幸

【摘要】小分子BH3模拟物，是一种十分理想的分子靶向抗癌药物，不过由于这种药物缺少足够的先导分子，因而在临床试验候选药物分子方面，仍具有分子药理机制的不足。人们对于BH3沟槽表面复杂功能、结构缺乏了解，使得药物分子理性设计受到限制。对此，应研究发现新的小分子BH3模拟物，能够在分子药理机制上发挥更大的优势。在研究分子靶向抗癌药物的过程中，采用此类小分子，对Bcl-2家族蛋白功能进行研究，使药物抗癌分子药理机制更为完善，了解BH3沟槽分子结构特征，进而为BH3模拟物理性设计提供依据。

【关键词】小分子BH3；模拟物S1；抗肿瘤；分子药理机制

【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）08-0232-03

肿瘤是一种十分常见的疾病类型，很多恶性肿瘤对患者身体健康影响较大，同时有较高的几率造成患者死亡。在Bcl-2家族蛋白中，Bcl-2-like蛋白具有抗凋亡作用，对于恶性肿瘤的存活发挥作用。在Bcl-2家族蛋白间的相互作用界面，BH3沟槽，使小分子抗癌药物最为关键的靶点[1]。相关研究表明，在Mcl-1、Bcl-2等蛋白BH3沟槽中，占据的小分子对于Bcl-2-like蛋白抗凋亡作用可进行拮抗，进而达到高特异性、广谱、高效的抗肿瘤作用。将此类分子，成为小分子BH3模拟物。

1.非DNA靶向小分子Mcl-1/Bcl-2双抑制剂S1

在对苊并杂环类DNA靶向分子的研究当中，存在特殊小分子S1，其无法使DNA双螺旋分子空间构象改变，也不能将超螺旋质粒DNA切断，但其细胞毒性则由于其它DNA靶向分子。如图1所示，在相关试验中，部分化合物损伤Ⅰ型超螺旋形式质粒DNA，电泳结果则显示缺刻型Ⅱ型DNA。在DNA、化合物S1共同作用下，也未出现Ⅱ型质粒DNA条带，因此说明其无法将超螺旋DNA切断。虽然小分子无法将DNA超螺旋切断，但可利用静电吸引、沟结合、嵌入等方式，和DNA之间产生相互作用，从而使DNA双螺旋空间构象发生变化。苊并杂环类小分子S1，经研究证明无法促使DNA构象的变化，也无法将DNA切断，因而属于非DNA靶向小分子。采取相关试验研究，比较DNA靶向分子和S1，杀伤培养肿瘤细胞的效果[2]。利用MTT法，检测化合物抑制人乳腺癌细胞、人宫颈癌细胞的效果。结果表明，小分子Ⅱ-1具有切刻超螺旋DNA的作用，对于两种癌细胞半致死浓度分别为8.4uM和7.2uM。小分子Ⅰ-3嵌入式靶向DNA小分子，对于两种癌细胞的半致死浓度分别使13.6uM和10.2uM。不过，非DNA靶向小分子S1，对于两种癌细胞可产生最强的抑制作用，因此，研究S1抗肿瘤分子药理机制，具有重要的意义。通过分别检测细胞凋亡的内源性途径、外援性途径，明确S1诱导凋亡的作用机制。对两种途径调往信号的区分，主要依据使caspase级联反应，研究结果表明，具有不同激活标志的内源途径（caspase9）和外援途径（caspase8），最终均通过相同作用机制（caspase3），诱导凋亡。对三种物质的活性进行检测，结果表明，采用浓度梯度的方式，将S1作用于人结肠癌细胞，可检测到caspase9激活，而caspase8、caspase3并未激活。作用时间不断延长，超过24h后，caspase9活性继续增加，caspase3的活性也明显提高。由此能够表明，S1属于调往诱导剂。

2.基于S1的Mcl-1蛋白BH3沟槽结构特征

经细胞学研究能够得出，S1可对Mcl-1蛋白发挥功能拮抗作用，经NMR研究，可以从结构方面表明，S1能够对Mcl-1的BH3沟槽进行占据，进而起到功能抑制的效果。基于S1对Mcl-1的BH3沟槽结构特征进行研究，先拆分S1分子，对利于小分子结合的热点结合单元进行研究。运用结构单元、分子片段的结合效率指标，可以对结构单元对小分子结合的贡献准确的体现。拆分S1，如图2所示，分别得到不同的片段，包括1-二氰基亚甲基-2-氧-苊（片段6）、苊醌（片段5）、氰基乙酰胺（片段4）、硫代吗呤（片段3）、8-氧-8H-苊并（1，2-b）吡咯-9-腈等（片段2）。利用这些片段分子，通过ELISA法对其Mcl-1蛋白亲和力进行检查。通过NMR研究证实，S1可通过片段中的羰基，结合精氨酸R263，形成氢键。羰基可能对完整分子S1和R263氢键作用模式加以保存，从而得到的关键作用力具有更高的配体效率[3]。对R263结构单元外亚口袋结构特征进行进一步的研究，使用片段6为hit进行分子生长，在R263A突变蛋白ITC实验中，片段6的亲和力和R263相当。不过无法和hotspot发生作用，因而片段6的配体效率要低于片段4。经ELISA检测发现，在取代基分子增加的同时，小分子对于Mcl-1将会产生更高的亲和力。所以，尽管片段6无法对R263进行占据，但可以对其亚口袋进行占据，从而提升亲和力。对片段7系列分子自由能对重原子数研究，结果表明二者之间具有线性的关系，且现行相关系数为0.98。另外，片段6系列分子，具有平行于片段4系列分子的优化路径，二者具有相同的斜率。对不同分子结构、不同分子大小的Mcl-1抑制剂进行相同的研究，选择棉子酚衍生物7系列、8系列，研究表明，其斜率比较接近于4系列和6系列，因而说明Mcl-1抑制剂和蛋白的结果，都会遵循特定斜率，并具有线性关系，同时不会受到分子结构、或R263结合位点的影响。这主要是由于Mcl-1蛋白亚口袋具有独特的性质。

3.高特异性BH3模拟物S1分子药理学机制

Mcl-1、Bcl-2但那白，能够利用BH3结合域分别和BH3-only蛋白、Bak、Bax的BH3肽段蛋白等产生分子识别，形成异源二聚体，对其促凋亡功能产生拮抗。对S1分别从定性、定量、体内、细胞内、体外等不同角度、不同方面进行研究，明确其与Bcl-2-like蛋白竞争结合的亲和力强度，对异源二聚体进行解离，使促调往蛋白得到激活与释放，进而发挥出抗肿瘤的效果。在Bcl-2家族蛋白中，Bak、Bax是发挥调往作用通路终点分子，在凋亡过程中，作为最终的执行者。很多研究对Bcl-2家族促凋亡、抗凋亡成员相互作用进行研究，其中Bcl-2蛋白、Bax蛋白具有相互影响和相互牵制的作用，对促凋亡、抗凋亡功能进行平衡[4]。S1在细胞内，可以作为双靶向BH3模拟物，对促调往蛋白、抗凋亡蛋白形成的二聚体进行解离，同时促进Bak、Bax的释放。采用细胞内荧光共振能量转移实验，通过不同时间、浓度条件，对S1干扰凋亡Bcl-2/Bax进行平行检测，从而证实S1通过对Bcl-2家族PPI干扰，对细胞凋亡进行诱导。Bak、Bax蛋白，在细胞中具有不同分布，其中Bak蛋白位置在线粒体，释放后能够和Bax、同源二聚体等形成异源二聚体，促进细胞色素c的释放，进而发挥诱导凋亡的效果。Bax蛋白在整个细胞中均有分布，部分在线粒体、部分在胞浆。细胞在凋亡压力下，胞浆Bax经构象改变，向线粒体外膜转移，从而促进细胞色素c的释放。Bcl-2家族蛋白之间，具有十分复杂的PPI，最终将Bak、Bax作为最终执行者，对细胞是否凋亡进行决定。研究结果表明，Bak/Bax完全依赖的细胞凋亡，就是S1诱导，因而S1在BH3模拟物中，具有较高的特异性。在人体中，小分子药物需经过血液循环，到达肿瘤组织。而药物进入肿瘤细胞后，其药物浓度是否能够保证对Mcl-2/Bcl-2靶蛋白形成足够的抑制作用，通过BH3功能的作用机制模拟，来诱导凋亡，对于小分子在人体中效果的发挥，低毒抗癌作用等都有着决定性的作用。

4.基于S1的Bcl-2家族药物靶点网络

在Bcl-2家族当中，抗凋亡Bcl-2-like蛋白是小分子发挥靶向、低毒、特异性抗肿瘤的一个良好的靶点。不过，很多研究发现，如果BH3只具有单一靶点，例如ABT-737等Bcl-2蛋白抑制剂，难以对肿瘤细胞Bcl-2家族网络进行有效控制。分别选择具有Mcl-1过表达的人白血病细胞系、人肝癌细胞系、人结肠癌细胞系，以及具有Bcl-2过表达的人小细胞肺癌细胞系进行研究。S1处理细胞当中，和体外检测S1拮抗Mcl-2、Bcl-2蛋白相同，处理24h之后，细胞都出现了浓度依赖细胞凋亡，同时具有较为接近的凋亡比例。因而能够看出，S1通过浓度依赖的方法，对Mcl-1高表达肿瘤细胞凋亡进行诱导，具有良好的作用效果。另外对S1诱导凋亡动力学过程，以及细胞Mcl-1蛋白表达量关系进行研究，结果表明，尽管S1可对高表达Mcl-1蛋白肿瘤细胞凋亡产生诱导，不过相比于Mcl-1地表达的细胞，凋亡作用时间显然更长，因而可见Mcl-1的高水平表达，会对大量调往产生延迟。Mcl-1蛋白寿命较短，其蛋白水平和Caspase降解体系、蛋白酶体系有着重要的联系[5]。采用Western印记试验，检测Mcl-1/Bcl-2蛋白水平变化，并采用特异识别活化caspase3抗体检测其激活情况。结果表明，Mcl-1地表达细胞，S1作用12h，Mcl-1蛋白水平降低，并检测到caspase3激活。随时间增加，Mcl-1蛋白水平持续下降，caspase3激活量也持续增加。可见在S1的作用下，Mcl-1动态变化，对于凋亡能够发挥调控的效果，细胞通过对Mcl-1蛋白的上调，抑制ABT-737诱导凋亡发生，延迟S1诱导凋亡大量发生。

5.小结

综上所述，小分子BH3模拟物S1，是一种十分有效的抗肿瘤化合物，能够对肿瘤分子产生有效的抑制。本文通过对其抗肿瘤分子药理机制的研究，为以后的临床试验、临床应用、个性化治疗等提供依据。

【参考文献】

[1]项喜艳,孙连坤.BH3-only模拟物S1通过活化SIRT3分子扰乱卵巢癌细胞糖代谢的机制[J].中国病理生理杂志,2015(10):1845-1845.

[2]王晓波,石敏,慕俐君,等.急性髓系白血病原代细胞BCL-2家族蛋白表达与BH3模拟物S1关系的研究[J].中国实验血液学杂志,2015,23(1):39-44.

[3]李景煜,刘宇博,宋婷,等.BH3模拟物S1诱导人类白血病细胞株K562凋亡的作用机制[J].白血病·淋巴瘤,2012,21(12):723-726.

[4]李亚平,钟加滕,衣豪伟,等.小分子化合物S1诱导B16细胞凋亡及其机制的研究[J].中国实验诊断学,2012,16(2):216-218.

[5]唐靖,罗丽娜,张海龙,等.基于procaspase-3激活的抗肿瘤活性分子SM-1吸收机制研究[J].长沙医学院学报,2015(1):542-546.

广西区自然，项目编号：2013GXNSFAA019229,项目名称：斑马鱼肠道肿瘤模型的构建

作者简介：彭云滔（1973-），男，汉族，湖南芷江人，研究生，讲师，肿瘤药理方向。