分光光度法测定茯苓中多糖的含量

熊婧1於小波2

（1武汉健民药业集团股份有限公司湖北武汉430052）

（2马应龙药业集团股份有限公司湖北武汉430064）

【摘要】目的建立茯苓中多糖的含量测定方法，分析不同产地和不同菌种培育茯苓中的多糖含量，为茯苓药材质量控制和评价提供参考。方法采用分光光度法，苯酚-硫酸法显色，检测波长490nm。结果葡萄糖在40～200µg/ml范围内线性良好，r=0.9999，平均回收率为99.72%，RSD为0.99%（n=6）。不同产地和不同菌种培育茯苓中的多糖含量差异较大。结论本方法简便快速、准确可靠、重复性好，可用于茯苓药材的质量控制。

【关键词】分光光度法茯苓茯苓多糖含量测定

【中图分类号】R927.2【文献标识码】B【文章编号】2095-1752（2012）18-0310-02

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，具利水渗湿、健脾、宁心之功效，主要用于水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、便溏泄泻、心神不安、惊悸失眠等症[1]。研究表明，茯苓中含有多糖类、萜类、甾体类、蛋白质等多种化合物，其中，多糖类化合物在该药材中含量甚高，具有抗炎症、抗氧化损伤和免疫调节等多个方面的生物活性，一直备受各国研究者的重视[2]。在现行《中国药典》2010年版一部茯苓药材标准中，尚无含量控制指标，故笔者采用分光光度法建立茯苓多糖含量测定方法，为茯苓药材质量控制和评价提供参考。

1仪器与试药

1.1仪器SHIMADZUUV-2041PC紫外-可见分光光度计，METTLERTOLEDOAL204型电子天平（万分之一），电子控温水浴锅等。

1.2试药茯苓样品分别采自湖北、安徽、云南等20个省区及28个不同菌种培育的茯苓药材，经湖北省中医药研究院王克勤教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Schw.）Wolf；浓硫酸、苯酚（分析纯）、葡萄糖标准品（购于中国食品药品检定研究院，原中国药品生物制品检定所）、水（重蒸馏水）；其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1茯苓多糖的提取纯化取新鲜茯苓，去表皮，切块，干燥，粉碎，过60目筛得茯苓粉末。取茯苓粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加25ml石油醚于70℃水浴中回流2h，冷却，过滤，滤渣干燥后加0.1mol/LNaOH溶液100ml，搅拌1h（＜5℃)，以3500r/min离心15min，取上清液。上清夜用10%冰醋酸溶液调pH值5～6，使其成糊状，离心，弃上清夜，残留物置透析袋中，用蒸馏水洗涤12h，离心得白色胶状沉淀，即为茯苓多糖。

2.2供试品溶液的制备取茯苓样品按2.1项下方法制得茯苓多糖，将其置200ml量瓶中，加水溶解至刻度，缓慢搅匀，精密量取0.5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得。

2.3对照品溶液的制备取葡萄糖标准品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加水制成每1ml含200μg的溶液，作为贮备液，即得。

2.4测定法取对照品或供试品溶液1.0ml，加入5%苯酚溶液1.75ml，摇匀，缓慢加入浓硫酸6.0ml，迅速摇匀，室温放置40min，在紫外-可见分光光度计490nm的波长处测定吸光度。

2.5线性关系考察分别精密量取40、80、120、160、200µg/ml的对照品溶液2.0ml，按2.4项下测定法测定吸光度，以浓度（C）对吸光度（A）进行线性回归，得回归方程为A=0.0044C+0.0256（r=0.9999），葡萄糖在40～200µg/ml范围内线性良好。

2.6精密度试验精密量取对照品溶液1.0ml，按2.4项下测定法测定吸光度5次，吸光度依次为0.439、0.437、0.437、0.438、0.438，RSD=0.19%（n=5），表明仪器精密度良好。

2.7稳定性试验精密量取供试品溶液1.0ml，于0、1、2、4、8、24h，按2.4项下测定法测定吸光度，吸光度依次为0.437、0.438、0.439、0.439、0.439、0.441，RSD=0.31%（n=6），表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.8重复性试验精密量取供试品溶液各1.0ml，共5份，按2.4项下测定法测定吸光度，吸光度依次为0.436、0.445、0.436、0.427、0.443，RSD=1.48（n=5），表明本方法重现性良好。

2.9加样回收率试验取已知含量的茯苓样品粉末6份，每份0.25g，精密称定，分别精密加入葡萄糖标准品约0.15g，按2.2项下方法制成供试品溶液，再按2.4项下测定法测定，平均回收率为99.72%，RSD为0.99%，表明本方法准确度良好。结果见表1。

表1加样回收率试验结果(n=6)

3讨论

3.1多糖类成分常用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、碘量法等测定含量，但由于蒽酮-硫酸法稳定性较差，线性关系不理想，重现性、稳定性所测数据差异较大，且蒽酮试液稳定性也较差，需临时配制，特别是加热后最大吸收峰偏移较大[3]；碘量法操作麻烦，且结果一般不够理想[4]，而苯酚-硫酸法是利用硫酸将多糖水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后和苯酚溶合成有色的化合物，即为橙黄色溶液，且颜色稳定，在适当波长处（490nm）有特征吸收，可测定多糖含量[5]，故笔者选用苯酚-硫酸法研究建立茯苓多糖的含量测定分析方法，结果表明该方法简便快速、准确可靠、重复性好。

3.2在测定波长的选择上，笔者分别将对照品和供试品溶液于紫外-可见分光光度计300～700nm之间进行扫描，两者均在490nm处吸光度最大，故选择490nm为测定波长。

3.3在显色条件选择上，笔者分别以加入5%苯酚溶液0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00ml考察苯酚用量，缓慢加入浓硫酸4.0、5.0、6.0、7.0、8.0ml考察浓硫酸用量，置于20、30、40、50、60℃的水浴和室温（约25℃）中考察显色温度，放置20、30、40、50、60min后测定考察显色时间，结果以5%苯酚溶液加入量为1.75ml，浓硫酸加入量为6.0ml，在室温下反应40min为最佳测定条件。

3.4根据不同产地和不同菌种培育茯苓中多糖含量测定结果（见表2、表3），不同产地和不同菌种培育茯苓中多糖含量差异均较大，表明产地生态环境、菌种来源对茯苓中多糖含量的高低均有着重要影响。进一步分析可知，无论产地还是菌种来源，以湖北、湖南、安徽茯苓中多糖含量较高，而福建、四川茯苓中多糖含量较低。

参考文献

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典（2010年版一部）[S]．北京：中国医药科技出版社，2010：224．

[2]沈玉萍，李军，贾晓斌．中药茯苓化学成分的研究进展[J]．南京中医药大学学报，2012，28（3）：297-299．

[3]钟方晓，任海华，李岩．多糖含量测定方法比较[J]．时珍国医国药，2007，18（8）：1917．

[4]张怡莎，陈华国，周欣，等．不同产地茯苓及茯苓皮中多糖成分的研究[J]．贵州师范大学学报（自然科学版），2010，28（3）：103．

[5]李真鹍，段启，李改云．茯苓多糖含量测定方法研究[J]．中兽医医药杂志，2011，（5）：27．