感染性腹泻分离培养技术与药物敏感试验技术

张晓兵

（肇东市第一医院黑龙江肇东151100）

【摘要】目的：探讨感染性腹泻病原菌分离培养技术与药物敏感试验技术。方法：选取2015年3月～12月收治的感染性腹泻住院患者43例便分离培养技术与药物敏感试验技术方法进行分析。结果：对急性感染性腹泻粪便，检出致病菌18株，其中贺氏菌属16株，肠炎沙门氏菌1株，绿脓杆菌1例。结论：腹泻病原菌种类繁多，实验室不可能对所有可能引起腹泻的病原菌都进行培养。为保证获得较高的检出率，可以对患者进行腹泻病原菌常规培养。

【关键词】感染性腹泻；分离培养技术；药物感试验技术

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2016）01-0078-02

肠道细菌学实验室主要从事临床感染性腹泻的病原学诊断，是临床微生物实验室的一个功能单元。在国内各级医院，肠道细菌学实验室或隶属于检验科的临床微生物室，或隶属于感染病科而成为一个独立的实验室。不论属于哪种模式，都必须符合临床实验室管理的基本要求和拥有肠道细菌检验的基本技术。

1.资料与方法

1.1一般资料

选取2014年1月～2015年10月收治的急性感染性腹泻性腹泻住院患者43例，其中男22例，女21例，年龄10～80岁，平均年龄42岁。腹泻每日3～10次，一至数日不等。便为稀水样便，粘液脓血便伴里急后重，多有发热，体温38～40℃。

1.2方法

1.2.1分离培养技术使用滤膜技术，直接在非选择性琼脂平板上放置灭菌的0.65μm孔径大小的醋酸纤维素滤膜。将10～15滴粪便悬液置于滤膜上，在35～37℃平板培养1小时。取下滤膜，将平板在微需氧条件下，37℃培养过夜(每毫升粪便悬液菌落数＞105才采用此方法)。此方法不如直接培养法敏感。采用可替代的弯曲菌平板37℃或42℃培养过夜。无血培养基Preston配方炭粉、头孢唑林、脱氧胆酸钠琼脂。用不含头孢噻吩的培养基，37％培养7天。

1.2.2药物敏感试验技术常用的抗菌药物敏感性试验方法有纸片扩散法、稀释法和E试验法。

1.2.2.1纸片扩散法该法由Kirby和Bauer建立，故又称K-B法。将细菌涂布在琼脂平板上，再贴上含一定量抗菌药物的药敏纸片，经35℃培养后量取纸片周围的抑菌圈直径，当该直径大于等于敏感限时为敏感，当该直径小于等于耐药限时为耐药，直径在敏感限和耐药限之间时为中介。某药的药敏试验结果为敏感时，临床上可考虑选用为抗感染治疗药物，耐药时临床不能应用[1]。中介是试验设定的一个缓冲区，防止因试验的微小误差而造成结果解释决然相反的严重错误。另外，当某药药敏试验为中介时，如果能够提高该药的用药剂量(如p-内酰胺类)，或感染部位该药物浓度很高(如喹诺酮类在尿中)，在没有其他更好的选择时该药亦可选用。纸片扩散法的优点是结果直观和易于理解，但是，纸片扩散法无定量结果，对于慢生长菌和扩散慢的药物不适用。

1.2.2.2稀释法将抗菌药物用肉汤培养基或琼脂培养基进行倍比稀释，然后接种试验菌，经35℃培养，以肉眼未见细菌生长的药物最小浓度判定为最小抑菌浓度。根据稀释介质的不同，又分为肉汤稀释法和琼脂稀释法；根据培养基用量的不同又分为宏量稀释法和微量稀释法。稀释法没有纸片法药敏试验简单、方便，测定结果是一个浓度值，尽管可根据MIC值的判断标准判断敏感、耐药和中介，但仍需要有经验的临床医师或检验医师根据临床情况加以分析和解释[2]。MIC的测定是药敏试验的标准方法，其结果准确可靠。当药物剂量必须严格监控时，纸片法不适用(如对于慢生长菌)时，纸片法结果需要进一步证实时，感染菌对无毒的β-内酰胺类药物耐药或中介需要大剂量进行治疗时，某些药物在尿或某个组织中浓度较高常规剂量可能奏效时，这些时候，常常需要MIC的测定结果来帮助进行分析和判断。

1.2.2.3E试验(Etest)：又称浓度梯度纸条扩散法MIC测定。本法融合了纸片法操作简单和稀释法可给出定量结果的优点，不仅可用于一般细菌的MIC测定，还可用于一些慢生长菌、厌氧菌和真菌。

2.结果

对急性感染性腹泻粪便，检出致病菌18株，其中贺氏菌属16株，肠炎沙门氏菌1株，绿脓杆菌1例。

3.讨论

腹泻病原菌常规培养腹泻病原菌种类繁多，实验室不可能对所有可能引起腹泻的病原菌都进行培养。为保证获得较高的检出率，可以对患者进行腹泻病原菌常规培养，包括沙门菌、志贺菌、气单胞菌、邻单胞菌、弧菌，也包括可引起菌群失调的金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和酵母菌。粪便标本至少应接种XLD(或SS)、EMB(或MAC或中国蓝)等培养基，必要时加血平皿。例如，血平皿+SS+MAC用于粪便常规培养。

肠道致病菌的分离培养应注意如下几点：SS培养基对部分志贺菌有抑制作用。常用的肠道选择性培养基(如SS等)对气单胞菌、邻单胞菌有抑制作用，初次分离时应接种血平皿和MAC。若用血平皿、XLD、EMB、MAC等培养基培养后，未检出常见致病菌，但感染性腹泻症状明显，可重新采集粪便标本接种GN肉汤，35℃培养4～6小时，再转种XLD等培养基，进一步分离培养。如怀疑沙门菌感染，可先用亚硒酸盐煌绿或四硫磺酸盐增菌液增菌，以提高检出率。怀疑耶尔森菌感染时，应进一步结合临床症状、病史做特殊腹泻病原菌的培养。

腹泻病原菌特殊培养项目及方法，正常人体肠道内可能存在金黄色葡萄球菌，因此只有每克粪便细菌数达到105CFU时才有临床意义。弧菌培养在沿海地区作为常规培养项目，内陆地区可作为特殊培养项目。在42℃或者特殊选择培养基上不能生长的弯曲杆菌通常引起小几率的感染。气单胞菌能够在常规的鉴别培养基如MAC和EMB上生长，但选择性培养基更有助于检出气单胞菌。选择性培养基：每10ml的BAP(血琼脂平板)培养基加入10mg氨苄西林(BAP-AMP)。邻单胞菌可以在一些常规鉴别培养基如MAC或HE生长，但选择培养基更有助于检出邻单胞菌。选择性培养基：肌醇一亮绿一胆盐琼脂。怀疑蜡样芽胞杆菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌感染应采集粪便、血清或可疑食物标本送至当地卫生防疫部门检测。怀疑耶尔森菌感染时，为了提高培养阳性率，可以将粪便作碱性处理，将粪便和0.5％KOH按1：2比例混合。旋转混合2分钟[3]。取混合物0.1ml接种于MAC平板，25℃或35℃培养48小时。SMAC可鉴别O157STEC。不发酵山梨醇的菌落为可疑菌落，如动力试验阳性可能为O157：H7STEC，需用诊断血清鉴别。非O157STEC用检测志贺菌毒素的方法鉴别。

早期培养物传代培养后使用增菌肉汤培养，能提高低数量菌的检出率。常用增菌液有GN肉汤用于沙门菌和志贺菌的增菌培养，严格保证培养4～6小时后即进行传代。SF肉汤主要用于沙门菌的增菌培养，培养12小时后尽快传代。Tetra肉汤主要用于沙门菌的增菌培养，但不包括伤寒沙门菌和副伤寒沙门菌，培养12小时后尽快传代。碱性蛋白胨水主要用于弧菌增菌，35～37℃培养6～12小时后，传代到TCBS平板上培养。

对于粪便培养中沙门菌和志贺菌，常规仅报告氨苄西林、一种喹诺酮类药和磺胺类药物的敏感试验结果。霍乱弧菌只做氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、氯霉素和磺胺异噁唑的药敏试验。首选氨苄西林。艰难梭菌引起的腹泻在停用抗生素之后，口服甲硝唑或万古霉素一般可以收到较好的治疗效果。不需做药敏测试。

【参考文献】

[1]郑孔秀，魏正东，马静，李顺才，周美园.感染性腹泻病原菌分离及药敏试验[J].实用预防医学.2000,7(5):360-361.

[2]潘剑英.430例急性感染性腹泻病原及药敏试验分析[J].山西预防医学.1999(2):108-109.

[3]孙本海，金仲品.1354份腹泻患者的粪便标本细菌培养鉴定及药敏试验分析[J].中国医疗前沿.2011,06(7):57-58.