结核分枝杆菌的耐药性检测方法

吕春林

【中图分类号】R521【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2011)8-0057-02

【摘要】在应用抗结核药物治疗结核病时，最为临床医师所关注的是细菌产生的耐药性。因为结核分枝杆菌对治疗药物不可避免的产生耐药性，而影响肺结核病的治疗效果。以致成难治型肺结核。

【关键词】抗结核药物耐药性检测

为使抗结核药物对肺结核病的治疗取得预期效果，在应用药物治疗之先，需要了解几个问题：

一、试管内的抑菌浓度

把抗结核药物加入培养基内，接种细菌以观察药物在多少浓度下能够抑制细菌生长，求出最小的抑菌药物浓度(MIC)，MIC是临床确定治疗药物剂量的依据。有关抗结核药物的MIC，请见短程化疗的细菌学基础。

应用不同培养基所测得的抑菌浓度有差异。如在改良罗氏培养基测得的抑菌浓度比液体培养基或半流体培养基测得的抑菌浓度偏高。

细菌在发育生长旺盛期对药物敏感，当细菌处于发育生长静止状态以致处于休眠期则药物不呈现抑菌效果。依据细菌发育生长的兴衰阶段，构成肺结核病治疗的基础。

二、血液内的药物浓度

血液内抗结核药物浓度测定是研究药物在机体内的吸收与排泄，疗效与毒性的关系，体液内药物含量、分布、对细菌的有效抑菌浓度等。可确定药物有效治疗剂量与用药次数等。

由于结核病类型和发病部位不同，病变性质不同，有的药物吸收比较快、有的药物吸收比较慢。有的体液内含药物浓度比较高，有的体液内含药物浓度比较低。即使在相同的药物治疗条件下，各器官、组织内的含药物浓度不尽相同，其间的差异是比较大的。

因此，血液内药物浓度的测定，在抗结核药物治疗前和治疗中均应进行药物浓度测定，以了解个体的药物代谢规律。对某些病例而言，可以起到抗结核药物治疗效果的监控作用。

一般规律。肌内注射法给药吸收比较快、口服法给药吸收比较慢。肌内注射法后30～60min，口服法后1～2h，血液内药物浓度即出现高峰曲线。

内科研究室用生物学方法，观察链霉素肌注后，药物在体内的吸收，排泄的规律性，提供的技术资料为肺结核病的治疗确定用药剂量和给药次数等以供参考。

口服利福平450mg后，按规定时间采集血液、尿液和痰液标本，用生物学方法测定药物在体液内的分布和排泄情况，利福平的吸收和代谢进程。

测定结果说明：口服利福平450mg后、3h血清内达到12fcg/ml的药物浓度、而痰液内的药物高浓度是在服药后6h含量3.31μg/ml.3h从尿液内排出的利福平剂量68.5μ/m1，至24h尿液内仍能够排出20μg/ml。

对脊椎结核病人应用异烟肼、链霉素、利福平、乙胺丁醇等药物的代谢进行观察。脓液内的药物浓度高峰曲线出现的时间不同，有的病人脓液内药物高峰曲线出现在4h,而有的病人出现在8h，说明个体和病变部位，以及病变性质等不同而出现药物浓度的差异。

化学测定法：此方法取得的结果虽然比较精确，但是，需要比较精密的仪器设备，如分光光度计、荧光光度计、紫外分光光度计等。此外，化学测定法需要标本数量较多，同一个化学测定法不能应用于血液、尿液、痰液、脑脊髓液和胸腹水等体液标本的检测。必须是不同体液应用各自的化学测定法。所以，临床实验室多采用生物学测定法。

生物学测定法：首先选取对抗结核药物最敏感的标准菌株。标准菌株先选对普通细菌敏感者，用普通细菌标准株进行测定，对普通细菌不敏感的药物，选用分枝杆菌进行测定。选妥标准菌株后，测得已知药物浓度的抑菌圈(带)直径(高度)，制备标准曲线表。再测定待检标本的抑菌圈直径。从标准药物浓度曲线表求得待检标本内的药物含量。

液相色谱测定法：液相色谱仪是比较精密的昂贵的仪器，尚不能为临床实验室所应用。

三、耐药性测定方法

多年来，许多方法提出用于结核分枝杆菌耐药性测定。目前有三种间接耐药性测定方法应用于临床细菌学检查实验室。即绝对浓度法，耐药比率法和耐药比例法。

长期以来国内各临床细菌检查实验室普遍应用绝对浓度法进行结核分枝杆菌的耐药性测定。

1.绝对浓度法试验是按照抑制某一控制接种物生长的最低药物浓度，耐药性的判定是以某一特定药物浓度的细菌生长超过某一确定的细菌菌落数(一般为20)而决定。

药物的“临界”浓度指抑制“野生”型亲代细菌生长程度，而对耐药性变异株达不到如此高的抑菌浓度。耐药“临界”浓度的确定需要各实验室对一定数量的“野生”株测定后加以决定。并应标准化。各实验室的耐药性试验结果才可进行比较。

绝对浓度法耐药性测定时，含药培养基的制备，待测菌液的配制和接种时菌液的均匀性等都是测定法中的关键。

培养基可以改良罗氏培养基或1％小川培养基。所用药品必须是纯品，按出厂数价计算剂量，在有效期内应用。

所用药物必须用分析天秤(1/1000)精确称量。对不溶于水的药物如利福平类、乙(丙)硫异烟胺、氮苯硫脲等药物称量后先用适量二甲基甲酰胺(或二甲基亚砜)完全溶解后，氟哌酸类药物加适量1%氢氧化钠液完全溶解后，再加水稀释至需用量。利福平类药物也可用无水乙醇或甲醇等试剂溶解。

待测菌株菌液的制备：取分离培养后生长的菌株转种在改良罗氏培养基生长旺盛的2～3周的菌落，用磨菌器仔细研磨成乳液样菌液、灭菌水稀释至1mg/ml的均匀菌液，备用。

试管法：试管法是目前临床细菌学实验室普遍应用的结核分枝杆菌耐药性测定法。具体操作法和步骤，见肺结核病诊断章，结核分枝杆菌实验室诊断技术。

微量法：微量法是70年代由川达村氏建立的结核分枝杆菌微型测定器检测耐药性法，又称试剂盒测定法。

直立扩散法：直立扩散法是用特制的直立扩散试管进行。试管高度与口径同中试管(18mm×180mm)。在试管上部约1/5处有约45度的弯度，以阻止培养外溢，使试管内培养基厚度保持一致。在试管侧面自下向上标有100mm的刻度，以便直接测出抑菌带高度。

2.比率法

此种测定法和绝对浓度法用相同培养基。制备一套平行的药物敏感性试验培养基。需要配制多个含药浓度的培养基。同时接种标准结核分枝杆菌(H37RV)和待测菌。以待测菌的最低抑菌浓度和标准菌的最低抑菌浓度之比，接种菌量必需标准化。

耐药结果判定：待测菌的耐药比率＞8者为耐药，耐药比率＜2者为敏感、耐药比率为4，按可疑或临界判定。

比率法需要进行标准菌株的对测定药物的MIC测定，需要很好设计一套平行的药物试验培养基。操作比较繁多，不举例试验说明。

3.耐药比例法

比例法是对照培养基和含药培养基、同时接种相同体积的稀释一定浓度的待测菌液。培养一定时间，在某一浓度的含药培养取得可计数菌落数和对照培养基取得可计数菌落数相比，以百分率表示之。大于1％者为耐药。

比例法耐药性测定比例法和绝对浓度法一样，均可采用直接耐药性测定法和间接耐药性测定法。

直接耐药性测定法是选择涂片抗酸染色阳性痰标本，经稀释后接种。由于痰标本内的细菌数量难以掌握以及对细菌是活菌或死菌的情况不明，接种后的培养基常无细菌生长等因果关系，直接法现不为实验室所应用。

菌液浓度，选用接种改良罗氏培养基生长2～3周的旺盛菌落，配1mg/ml的菌液，以灭菌水稀释至10-2、10-4的菌液，分别接种对照培养基和含药培养基(各接种0.01ml)。

结果与报告：接种后，37℃孵箱培养4周报告耐药性测定结果。如果对照培养基生长的菌落数目在5个以下，应重复试验，含药培养基未生长出可计数菌落，也应重复试验。

计数对照培养基和含药培养基上生长菌落数，计算出耐药菌的百分比。

参考文献

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