基因敲除技术在药学领域中的应用及进展

桑妍蕾

【摘要】基因敲除是自上世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，可通过一定途径使机体某种特定的基因失活或缺失，是目前在生物医药领域对某一具体基因功能研究的热点。本文主要介绍了基因敲除技术的原理及方法，并对其在药学领域的具体应用进行了综述。

【关键词】基因敲除基因同源重组ES细胞

【中图分类号】R319【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）26-0058-02

距离DNA分子双螺旋结构的发现已整整六十年，这六十年里，分子遗传学、分子免疫学、细胞生物学等新学科如雨后春笋般地出现，基因重组、小干扰RNA、原位杂交等分子生物学新技术日新月异地发展，一个又一个生命的奥秘从分子角度得到了更清晰地阐明，为进一步揭示生命现象的本质打下了坚实基础。随着人类基因组工程的进展和完成，21世纪我们已进入后基因组时代。人们利用已经破译的人类遗传密码，展示了一个崭新的生物医学研究领域。有针对性地将某段具有生物学活性的基因遮盖，使其失去某种生物学活性，即所谓的基因敲除技术，是目前在生物医学领域对某一具体基因功能研究的热点。本文的主旨是对基因敲除技术的原理、方法、及其在药学领域的相关应用进行初步综述。

一、概念及原理

通常意义上的基因敲除主要指的是基因同源重组，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和免疫核糖核酸（immuneRNA，iRNA）。

二、研究方法

将连接在载体上的改造后的目的基因导入靶细胞后，基因整合成功的靶细胞将发育成转基因动物。当靶细胞为动物的胚胎干（embryonicstem,ES)细胞时，外源基因与靶细胞染色体可发生同源重组而实现外源基因的定点、单拷贝整合，被称为“基因打靶”。在外源基因的3’-外显子编码区插入编码抗生素抵抗性蛋白的标志基因，5’-端启动子区插入目标基因，导入ES细胞后，发生正确同源重组的细胞具特定的抗生素抗性，能在条件培养基中存活，其他非目的基因被定点灭活，经此筛选的克隆以显微注射法导入动物胚泡发育成杂合子，再经过传代筛选得到纯合子，即为“基因敲除”动物。

利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：

a.基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，成为重组载体。

b.ES细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠。[1,2]

c.同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的ES细胞中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。[3,4]

d.选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低,目前常用正负筛选法（positive-negative-selection，PNS法），标记基因的特异位点表达法以及聚合酶链反应法（PolymeraseChainReaction，PCR法）。其中应用最多的是PNS法。[5]

e.ES注射入囊胚：通过代孕母鼠进行嵌和体小鼠的繁殖。

f.表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的[1,2,6]。

g.得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。[7]

三、在药学研究领域的应用

(1)基因操作技术在药物代谢酶系研究中的应用

细胞色素P450（cytochromeP450，简称CYP450）药物代谢酶超家族是生物体内参与各类外源性及内源性物质代谢的主要酶系，在临床绝大多数治疗药物以及多种化学性毒物、前致癌物或致突变剂的生物转化作用中占有举足轻重的地位。长期以来，由于医学伦理学的原因，大量新药的药物代谢动力学及药效学的结果无法在人体直接观察；而以实验动物为对象的研究结果又由于CYP450酶系种属间差异的问题，无法直接推及于人。近年来通过基因技术而建立的CYP450基因敲除以及基因敲入小鼠整体模型，为解决上述问题提供了极大的便利。

利用基因敲除小鼠可观察在特定基因缺失的条件下动物对药物的代谢情况。目前已建立了多种CYP450小鼠整体动物模型。CYP450基因敲除小鼠为研究在哺乳动物组织中表达方式与催化活性高度保守的，无显著种属差异的P450酶提供较理想的整体模型，但不适于研究某些人类特异表达的P450酶。采用基因打靶技术，还可在敲除小鼠内源性基因的基础上转入人类CYP450基因，制备人源化动物整体模型。将特异性启动子与目的基因组成融合基因制备的转基因小鼠，还可调控CYP450的时间或组织细胞特异性表达。

将基因操作技术应用于CYP450药物代谢酶的研究，已成为国际生物工程研究领域的竞争热点。基因敲除和转基因动物为药理学、毒理学研究提供了可靠的动物模型，也为新药开发提供了一条与人体内环境近似而又基于整体动物水平的高通量筛选途径。虽然目前仍存在诸多有待于克服的问题，如模型制备周期较长，转入的外源性基因拷贝数和整合位点随机性大，以及由于传代难而无法大规模生产等，但随着研究的深入上述问题将逐步得到解决。

(2)基因敲除技术在药物成瘾机制研究中的应用

药物成瘾是一种由滥用药物与大脑奖赏系统相互作用产生的慢性、复发性脑病，主要表现为强迫性用药症状和持续性渴求状态，给患者本人带来极大痛苦，也造成严重的社会危害。药物成瘾会引起中脑边缘系统多巴胺和非多巴胺神经元的受体及信号转导系统发生复杂的适应性变化，进而出现成瘾行为。药物成瘾研究属于行为药理学范畴，传统方法采用特异性拮抗剂或激动剂进行动物实验研究，以阐明相关机理。但是，已有的拮抗剂药理作用广泛，缺乏高度特异性，并且很多生物活性蛋白质(尤其是受体亚型和细胞内信号转导分子)目前还没有选择性拮抗药物，因此大大制约了药物成瘾机制研究的进展。

80年代后期以来，由于真核细胞基因转移和实验胚胎学技术的进步，使得在动物体内进行基因操作成为可能。基因敲除技术已成为包括生物医学在内的多个领域研究的重要手段，虽然在药物成瘾机制研究中该技术应用较晚，但是相关报道正在逐年增多。

靶向基因敲除技术已成为进行药物成瘾机制研究的强有力的新型手段，并得到了成功应用，但目前基因敲除小鼠的种类仍较少，需要建立更多的单基因敲除小鼠模型。同时，由于药物成瘾性的发生涉及多种基因产物的相互作用，迫切需要建立多基因敲除小鼠模型。另外，基因敲除技术的两个主要缺点限制了其在研究中应用：一是靶向基因突变的非组织特异性，因为某些再脑中表达的基因也可能在外周细胞中表达，如能将基因突变限定在某特异脑区，则会更有利于药物研究，组织特异性条件性基因敲除技术的产生为此提供了可能性；二是发育早期发生的突变，在发育过程中可能发生同家族基因或功能相似基因产生代偿性表达，这样观察到的效应可能是替代基因的作用，所以在解释与突变基因相关行为时应非常谨慎，时间选择性诱导基因敲除技术有望解决此问题。

一旦组织特异性条件性和时间选择性诱导基因敲除技术成熟，那么将为我们进一步认识药物成瘾的分子机制提供非常实用的研究工具，尤其是将基因突变技术与传统药理学实验方法结合后将产生巨大的威力。该技术将会像传统药理学中的拮抗剂或脑结构及神经通路损毁剂一样，用于来研究内源性神经化学物质和神经解剖学通路的功能，因此基因敲除小鼠模型在药物成瘾机理研究方面有着广阔的应用前景。

(3)基因敲除模型与药物作用新靶点的发现

关于药物作用的靶基因，据文献报道，目前已上市的药物的作用靶点只有约120个，而人类基因组中大约有5-10万个基因，因此运用基因敲除技术来寻找药物作用新靶点仍具有很大的潜力，很快成为医药行业的焦点。通过药物作用的新靶点来设计开发新药是目前国外创新药物开发的一条重要线索，如COX-2、PDE5、BCR—ABI等新靶点的发现，引发了一系列新药研发。1998年，以COX-2为作用靶点的新药赛来西布作为治疗关节炎的新药通过审批，COX-2作为该药的作用靶点第一次实现产业化；同年，西地那非作为治疗勃起障碍的新药上市；2001年通过审批的Gleevec能够抑制BCR-ABL致癌基因，对治疗慢性髓样白血病(CML)是一个重大的突破，使大多数处于CMI慢反应期的病人在血液学和细胞遗传学方面的症状得以缓解。虽然，目前每年只有2～3个作用于新靶点的药物上市，但这些新的靶点为治疗疾病提供了全新的作用机制，为一些以前无法治疗的疾病提供了新的希望，具有巨大的潜力。

由于基因敲除表型与作用机制和相关疾病的治疗存在密切的联系，因此在制成基因敲除小鼠模型后，可以采用一个初级的表型筛选来确定药物在心脏、脂代谢、免疫、神经、精神病、眼科、骨科、生殖和肿瘤学中的具体作用靶点。这一研究足已覆盖几乎所有的蛋白质和可用于药物研究的基因家族，如离子通道、核激素受体、蛋白酶、磷酸二酯酶、激酶、磷酸酶及其它关键的酶类。基因敲除模型不仅在发现具体基因功能和药物作用新靶点方面具有高度价值，同时也有助于确定药物作用于特定靶点后的不良反应。这些研究都为未来的药物开发提供了丰富的靶资源。

可以预见，鼠类遗传学和基因组敲除技术的结合和共同发展，将为探寻药物作用新靶点提供一个更高效便捷的研究手段，从而极大地促进新药研发，有利于在疾病治疗方面取得突破性进展。

四、基因敲除的缺点及局限性

（1）操作复杂，实验周期长，费用偏高；

（2）在敲除过程中，被破坏的常常只是靶基因的部分外显子而并不是整个编码区，残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能，这给表型分析带来麻烦；

（3）对于某些必需基因，敲除后会造成细胞死亡，也就无法研究这些必需基因的功能；

由于基因功能上的冗余，敲掉一个基因并不能造成容易识别的表型：基因家族的其他成员可以提供同样的功能；

（4）同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除，获得的表型差异很大。

总的来说，基因敲除小鼠模型的建立周期长，技术含量高、风险性大。至今国内外仍没有在基因打靶方面取得突破性进展使得此技术能够满足快速化、高通量研究基因功能的要求。

参考文献

[1]Muller,-U.Tenyearsofgenetargeting;targetedmousemutants,fromvectordesigntophenotypeanalysis,Mech-Dev,1999Apr;82(1-2);3-21.

[2]Ledermann,-B.Embryonicstemcellsandgenetargeting.Exp-Physiol.2000Nov;85(6);603-13.

[3]ARMINHALLMANN,ANNETTERAPPEL,ANDMANFFREDSUMPERGenereplacementbyhomologousrecombinationinthemulticellulargreenalgaVolvoxcarteriProc.Natl.Acad.Sci.USAVol,94,pp.7469-7474,July1997.

[4]ThomasP,homologousrecombinationinhumanEScellNaturepublishonline200310Feb.

[5]刘德培方福德基因敲除生理科学进展199526-1.

[6]NelsonRJ,YoungKA,Behaviorinmicewithtargeteddisruptionofsinglegenes.NeurosciBiobehavRev1998;22:453-62.

[7]AndrewHolmesTargetedgenemutationapproachestothestudyofanxiety-likebehaviorinmiceNeuroscienceandBiobehavioralReviews25(2001)261-273.