黔东南州少数民族健康人群CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞正常参考区间的建立

孔义华（通讯作者）王显河聂兴旺邹远芹潘盛榕

关键词：CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞计数；正常参考区间；流式细胞术

CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞是细胞免疫应答中心，人体免疫力下降，可导致CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞数量减少，而继发性免疫缺陷，在免疫系统中的T淋巴细胞亚群中起着重要的作用，这种疾病可以导致传染病、癌症、自身免疫性疾病、免疫缺陷病和其他疾病，以及CD4+比例、CD4+/CD8+比值可作为获得性免疫缺陷综合征（AIDSimmunedeficiencysyndrome比绝对值），为白血病和淋巴瘤研究和治疗提供重要参考。最近的研究表明，CD4+CD25+调节患者免疫功能的T细胞恶性肿瘤有效的判断和治疗活性，CD8+CD28+（细胞毒性T细胞）的含量是密切相关。国内外的CD3+、CD4+、CD8+细胞CD8+CD8+。CD4+/CD8+报道更多的7-9，但对CD4+CD25+、cd4+cd45ra+一些研究，大样本CD8+CD28+3T淋巴细胞表型，通过流式细胞仪检测，使用不同的实验室，不同的试剂，统计数据的方法不同时，没有统一的T淋巴细胞亚群的正常参考范围，因此有必要建立局域网，在实验室参考区间T淋巴细胞亚群、基础研究、临床诊断和治疗提供参考。

1对象和方法

1.1研究对象

黔东南州少数民族还不在当地人口生物参考区间建立CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞计数。本研究在外周血中，用流式细胞仪检测了黔东南州少数民族140例健康成人的CD3+、CD4+、CD8+T细胞，用PAS法测定了健康成人生物参考区间康的局部成人外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞。333份样本来自黔东南州少数民族常住人口，随机选择19～85岁之间的检查，患者的平均年龄36.4岁，男性169人，女性164人。这些患者健康，无病史，血细胞计数和肝功能检查正常，排除人类免疫缺陷病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，梅毒感染和免疫系统疾病。

1.2测试仪器及试剂

样品是在早上7：00到9：00，收集，用EDTA抗凝钾三（美国BD公司）收集了3毫升的血，立即确定淋巴细胞百分比、血白细胞计数和白细胞、淋巴细胞绝对值计算，其余样品由样品处理和流式细胞仪检测样品制备6小时。

采用BDFACSCantoll（六色的）流式细胞仪。荧光抗体：CD4三藻红蛋白（藻红蛋白，PE/CD8）-异硫氰酸荧光素（FITC荧光异硫氰酸酯（CD3）/甲藻甲藻叶绿素，叶绿素蛋白复合体、CD4-FITC抗体、CD25-PE抗体）、CD45RAFITC标记的抗体，CD4-PE抗体，CD8CD28、双抗体等。

1.3标本的采集与检测

1、在BD计数器是10升和50升的血三基色荧光试剂在室温下混合后（20~25℃）避光孵育15~30分钟450升流式细胞溶血，15分钟，在室温下充分混合的阴影4C存储后2h检测。

2、在测试前，先启动facscomp软件，和calibrite试剂校准仪器。珠海试剂标记添加1滴第试管提取试剂盒，和鞘液的混合物；1毫升，4（FITC、PE、叶绿素、试剂、标记）在试管中加入2毫升每两1滴混合和鞘液。然后检查仪器校准、流式细胞仪和光流法，确定变异系数（CV、CV＜2%）。采用fitc-igg1/pe-igg1/pecy5-igg1荧光阴性护理设置的同类型的线，然后9个检测程序运行，T淋巴细胞亚群检测，每个样品至少10000个细胞是由数管测量，确保门包括超过97%的淋巴细胞、单核细胞不超过3%。每个测试的质量控制分别为1和2，并确保每个质量控制结果都是质量控制和测试。

1.4统计学处理

用SPSS13软件进行统计分析，P＜0.05系统差异，所有数据均有统计学意义。正态分布且方差齐性，所以在所有年龄组的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞计数结果均值比较采用方差分析，CD3+、CD4+、CD8+T细胞在男性和女性之间的同年龄组与两独立样本t检验的均值相比，采用x±1.96s确定参考区间。

2结果

2.1异常值剔除

观察记录黔东南州少数民族333例健康成人CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞计数结果.

表1黔东南州少数民族不同年龄和性别的健康成人

CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞计数结果比较（个/uL）

表1所有年龄组的不同性别的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞数显示，不同年龄组和同年龄组男女之间的平均CD4+T淋巴细胞计数差异无统计学意义（P＞0.05）；合并后各年龄组的性别计数数据中，男性CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞计数为817±182.6；女性CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞计数792.6±211.9。通过两个独立样本t检验，T淋巴细胞平均数无显著性差异（t＝0.732，p＝0.465）。由于CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞平均数无显著性差异，所有研究对象均获得正态分布的CD4淋巴细胞计数结果。

3、讨论

胸腺中的T细胞、胸腺基质细胞中的骨髓造血干细胞前体细胞和细胞因子，分化为具有不同抗原特异性T细胞受体的功能性T淋巴细胞，是百万生殖系基因之一。通过对T细胞胸腺基因的遗传重排。T淋巴细胞由于遗传和个体差异，免疫系统受年龄、性别、遗传效应的影响，导致个体t淋巴细胞亚群与区域、种族、个体差异，受性别、年龄变化的影响，已在研究中得到证实。在黔东南州少数民族医院收治的333例样本检测，CD3+，CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+比值、CD4+CD25+、CD8+CD28+、比例的绝对值，当地正常参考区间的建立，提供正常外周免疫和临床研究的基线数据。根据统计分析的结果表明，CD3+、CD3+、CD4+、CD4+／CD8+、CD4+CD45RA+，女性高于男性。

近年来，一些学者指出，性别差异在10阳性细胞的比例，可能的原因是，女性在生殖道内的淋巴组织分布，除此之外，两者的解剖分布的淋巴组织是一样的，所以可以用它来解释女性CD3+CD3+CD3+、CD4+、CD8+T细胞的遗传机制比高于男性，当然，这种负面结果的机制是女性的自身免疫性疾病的发病率明显高于男性，随着年龄显著改变T细胞亚群，包括CD3+CD8+、CD4+／CD8+、CD4+CD25+、cd4+cd45ra+，年龄和CD8+CD28+变化特别近，有大的年龄差异，差异越大。免疫衰老过程的原因非常复杂，T细胞的变化是重要过程的重要特征。

免疫衰老：T细胞受体基因多态性与减少记忆/效应T细胞的积累，胸腺退化，初始T细胞（CD4+CD45RA+）消费和慢性炎症老化11-12；CD4+和CD8+细胞端粒长度与年龄在13岁的时候，长的端粒，端粒酶的表达，深层次的原因在这项研究中需要进一步调查，我们比较了年龄组现在最小的I组（19~29）中cd4+cd45ra+显著高于其他年龄组。可能的解释是，初始TCD45RA+细胞增殖反应的抗原，CD45R表达降低，表面上，和T淋巴细胞的免疫原的抑制（非致敏T细胞）和记忆T细胞的辅助作用下降。在某些病毒感染后CD4+CD45RA+，和数会增加再次接受抗逆转录病毒治疗后；在活跃的多发性硬化症，其表达下降，很多患者的CD4+CD45RA+T细胞在过敏性疾病外周血高于正常，临床疾病的诊断和治疗，其差异应考虑年龄因素。

T辅助激活最早出现于二十世纪初，被认为具有T细胞亚群的调节功能，一段时间以来一直被命名为T细胞。随着研究的深入，发现调节性T细胞的表面标志是理想CD4+CD25+。在CD4+CD25+细胞动物模型可增强NK细胞杀伤肿瘤的能力16、F4和karagZ6cd4+cd25+是报道增加细胞瘤患者的预后。临床结果也证实肿瘤患者的CD4+CD25+正常对照组明显增加。

CD28T细胞活化所需第二重要的成员，T细胞表面的共刺激分子CD28和抗原递呈细胞表面的B7（CD80、CD86）二分子信号在T细胞活化的T细胞的相互作用，促进基于T合成和细胞增殖因子IL-2的转录。共刺激信号，导致缺乏T细胞无能，降低T细胞的活化和增殖水平直接导致抗感染（特别是病毒感染）在细胞免疫功能下降和组织相容性复合体限制细胞功能损伤。研究发现，随着年龄的增长，CD8+CD28+淋巴细胞表型的比例和降低。CD28、T淋巴细胞活化的信号可以降低两表达，老年人机体具有免疫清除和免疫监视系统。抗损伤、感染和肿瘤的能力（导致肿瘤免疫逃逸）下降，是导致老年人感染和癌症高发的原因之一。

虽然T淋巴细胞亚群的性别，年龄，性别，年龄（除非有特殊需要测试某个年龄的建立可以结合参考区间），黔东南州少数民族的数据是基于对T淋巴细胞亚群参考范围的测试数据，与国内的相关研究文献与国外稍有不同的数据，但绝对值并不多，主要有区域、民族的差异，对最大最小值的中位数分析发现存在个体差异，所以在CD3+T淋巴细胞亚群检测，CD3+CD8+、CD4+/CD8+不仅是由免疫状态决定的，每个人都有其独特的变化，T淋巴细胞亚群有更好的对疾病发生和发展的动态进行判断。本研究结果表明，黔东南州少数民族健康成人外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的参考范围为（804.7±387.3）相似结果的范围内，此外，本研究结果显示，健康成人外周血不同年龄和性别的CD4+T淋巴细胞之间没有区别。

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基本项目：黔东南州科技计划项目“贵州省苗族、侗族健康人群CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的正常参考值研究”（项目合同号：黔东南科合J字（2014）4031号）