单纯法与复合法四氯化碳诱导家兔肝纤维化模型的对比研究

刘满荣1丁可2,3唐建华4唐一兵2马宇3

1南宁市第二人民医院超声科广西南宁530031；

2南宁市第二人民医院放射科广西南宁530031

3桂林医学院附院放射科广西桂林541001；

4桂林医学院附院超声科广西桂林541001

【摘要】目的探讨单纯法与复合法四氯化碳（carbontetrachloride，CCl4）诱导建立家兔肝纤维化模型的效果。材料和方法将20只雄性健康家兔随机平分为2组，单纯法造模组仅给予皮下注射0.5ml/kg的纯CCl4(每周2次)，复合法造模组则在此基础上配以饲喂高脂低蛋白食物，并给稀释成10%的无水乙醇作为唯一饮料。于给药后4、8、12周在B超引导下行肝穿活检，对比研究两种方法建立家兔肝纤维化模型的效果。结果家兔死亡多发生在4周之内，5周之后趋于稳定。单纯法总的肝纤维化成模率为80%，但8周存活兔成模率只有75%，12周时也仅有71%的存活兔发展为肝硬化。复合法总的肝纤维化成模率为70%，但8周存活兔成模率达100%，且12周存活兔全部进展为肝硬化。结论复合法皮下注射CCl4造模家兔肝纤维化形成时间较短,成模率高，是制作肝纤维化模型较好的方法。

【关键词】四氯化碳肝纤维化动物模型家兔

【中图分类号】R36【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）02-0083-02

肝纤维化是慢性肝病的重要病理特征[1]，也是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段。肝纤维化向肝硬化发展是一个可逆的过程[1]，晚期肝硬化则难以逆转，因此，阻断肝纤维化发展就成为慢性肝病防治中的关键问题[2]。建立良好的肝纤维化动物模型是开展肝病防治研究的重要基础，家兔为常用模型，但不同造模方法的效果有所不同，本实验拟对单纯法与复合法四氯化碳（carbontetrachloride，CCl4）诱导建立家兔肝纤维化模型进行对比研究，以期为慢性肝病的防治研究提供较好的造模方法。

1材料和方法

1.1实验动物

选用6月龄健康雄性普通级新西兰大白兔20只，体质量2.0～2.5kg,由桂林医学院实验动物中心提供。随机平均分为单纯法造模组及复合法造模组，每组10只。所有家兔均饲养在层叠式不锈钢丝笼中，兔房通风良好，噪音较小，保持清洁，空气湿度为50%～70%，温度为20～29℃。

1.2实验试剂及肝穿刺活检枪

实验试剂：分析纯CCl4（≥99.5%），广东西陇化工股份有限公司生产。肝穿刺活检枪：半自动型活检针，制造厂商为日本TSK株式会社，规格型号“18GL-130mm”。

1.3模型制作

分笼正常喂养适应环境1周后开始进行造模。单纯法造模组给予皮下注射0.5ml/kg的分析纯CCl4，每周2次，以基础颗粒状饲料（由桂林医学院实验动物中心提供）喂养，自由饮用自来水。复合法造模组首次CCl4注射剂量为0.2ml/kg，之后均给予皮下注射0.5ml/kg的CCl4，每周2次，配以饲喂高脂低蛋白食物（基础颗粒状饲料与胆固醇混合组成），并给稀释成10%的无水乙醇作为唯一饮料。分别于给药后的第4、8周，在B超引导下行肝穿刺病理活检，标本长约1.5～2.0cm。造模中途死亡的家兔立即取其肝脏进行病理学检查。造模后第12周，采用耳缘静脉注射空气栓塞法处死存活的所有实验兔，取大小约0.3cm×1.0cm×1.5cm的肝脏标本送病检。

1.4病理学检查

所有肝脏标本均以10%的甲醛固定，常规石蜡连续切片,分别进行苏木精—伊红(HE)及Masson三色染色病理观察。以2000年西安会议方案为标准[3]，根据纤维组织增生情况，将肝纤维化分为S0～S4五期。

1.5统计学分析采用SPSS17.0专业统计软件包进行统计学分析。单纯法与复合法CCl4造模两组死亡率的比较采用四格表资料x2检验（四格表确切概率法），P＜0.05认为差异有统计学意义。

2结果

两种方法造模后1～12周家兔死亡情况见表1。可见家兔死亡多发生在4周之内，5周之后趋于稳定；至12周，复合法的死亡率略高于单纯法，但差异无统计学意义（Ｘ2值=0.220，P=0.639＞0.05）。实验发现家兔死亡多在给药后24-48小时发生，其余3只则发生于肝穿刺后的数日。病理显示1～2周死亡兔仅可见不同程度的肝细胞肿胀、坏死，均未形成肝纤维化。

表1两组家兔用药后1～12周（W）死亡情况

*可见肝纤维化形成的死亡兔，**可见明显脂肪变的死亡兔

两组家兔用药后肝纤维化情况及建模成功率见表2。单纯法造模总的肝纤维化成模率为80%，但8周时存活兔成模率只有75%（6/8），12周时也仅有71%（5/7）的存活兔发展为肝硬化。复合法造模总的肝纤维化成模率为70%，但8周存活兔成模率达100%（7/7），且12周时存活兔全部进展为肝硬化（6/6）。

表2两组家兔用药后肝纤维化情况及建模成功率

3讨论

3.1CCl4诱导肝纤维化的原理及意义

CCl4是氯化烷烃类化合物，为一种选择性肝毒性药物，其主要作用机制为：CCl4进入机体后，首先经肝细胞微粒体细胞色素P450激活，生成活性的过氧三氯甲基自由基(OOCl3)和三氯甲基自由基(CCl3)，通过攻击肝细胞膜的磷脂而启动脂质过氧化作用。CCl3-还可与蛋白质共价结合，损害线粒体导致还原性辅酶A(NADH)和三磷酸腺苷(ATP)在肝内生成减少，进而抑制脂肪酸氧化和三羧酸循环。此外，由于内质网受损可导致脂蛋白合成障碍，使三酰甘油和脂肪酸在肝细胞内蓄积，形成脂肪变性。因此，长期反复的CCl4刺激可诱导肝纤维化和肝硬化形成[4]。用CCl4诱导的肝纤维化模型可广泛应用于研究肝纤维化发生的细胞及分子机制、血清学标志物与组织病理的相关性以及抗纤维化药物的筛选。

3.2CCl4给药途径及时间的选择

CCl4诱导建立肝纤维化模型的途径有口服、腹腔注射和皮下注射等。周贤等[5]将Wistar大鼠随机分成血清组、CCl4皮下注射组、CCl4腹腔注射组进行肝纤维化造模，研究显示CCl4皮下注射组制备肝纤维化模型的动物死亡率较低，肝纤维化形成时间较短，是一种制作肝纤维化模型较好的方法。CCl4进入体内15分钟即可引起肝细胞损害，至48小时达到高峰，随后进入修复阶段；间隔三四天注药1次，即在一次染毒造成肝损害后的修复期再次给药，重复“损害-修复-损害”的过程，即可诱导肝纤维化形成[6]。结合文献报道，本研究采用皮下注射法进行造模，并确定了2次/周的给药频率。

3.3单纯法与复合法CCl4造模的比较

CCl4为肝脏剧毒药物，肝毒性作用迅速而剧烈，进入体内48小时肝细胞损害达到高峰，易导致动物急性中毒而死亡，故实验中家兔死亡多发生在给药后24-48小时。经过一段时间的适应期，动物对CCl4的耐受性相对增强，所以家兔死亡多发生在4周之内，5周之后趋于稳定。1～2周死亡兔病理学显示大片状肝细胞肿胀、坏死，印证了CCl4的剧烈毒性作用。另外有3只家兔于肝穿刺后的数日死亡，考虑与实验兔受药后体质下降，肝功能损害导致易出血倾向或穿刺后急性创伤有关。

无水乙醇能诱导P450的活性从而增加CCl4的肝毒性，加速肝细胞的变性和坏死，而高脂低蛋白物质侧能加重肝细胞的负荷，从而使得肝硬化形成时间缩短。可能基于上述原因，本实验复合法CCl4造模的死亡率略高于单纯法，但复合法的第8周存活兔肝纤维化成模率达100%，且12周时存活兔全部进展为肝硬化，均高于单纯法的成模率。CCl4单因素造模成模时间较长，而单纯加大CCl4剂量则会增加动物死亡率。采用复合因素造模，不仅可以缩短造模时间，而且成功率大为提高[7]。曾燕等[8]的研究亦显示，在注射CCl4的同时采用辅以5%浓度的乙醇作为饮水,使家兔肝纤维化的造模时间在12周内全部完成。由此可见，在安全剂量的前提下，复合法的分析纯CCl4造模家兔肝纤维化形成时间较短，成模率高，是制作肝纤维化模型较好的方法。

参考文献

[1]RamachandranP,IredaleJP.Reversibilityofliverfibrosis[J].AnnHepatol,2009,8(4):283-291.

[2]FallowfieldJA,IredaleJP.Reversalofliverfibrosisandcirrhosis-anemergingreality[J].ScottMedJ,2004,49(1):3-6.

[3]中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案[J].中华传染病杂志,2001,19(1):56-62.

[4]WangL,PotterJJ,Rennie-TankersleyL,etal.Effectsofretinoicacidonthedevelopmentofliverfibrosisproducedbycarbontetrachlorideinmice[J].BiochimBiophysActa,2007,1772(1):66-71.

[5]周贤,刘翼,夏国栋,等.肝纤维化动物模型探讨[J].四川动物,2010,29(1):114-115.

[6]王宝恩,王志富,殷蔚荑,等.实验性免疫性肝纤维化模型的研究[J].中华医学杂志,1989,69(9):503-505.

[7]HungDY,ChangP,CheungK,etal.Quantitativeevaluationofalteredhepaticspacesandmembranetransportinfibroticratliver[J].Hepatology,2002,36(5):1180-1189.

[8]曾燕,赵建农,冷志,等.不同浓度四氯化碳复合法诱导家兔肝纤维化模型的建立[J].第三军医大学学报,2009,31(8):694-696.

基金项目：广西自然科学基金资助项目（2010GXNSFB013088）