补气通络解毒方对胰腺癌模型小鼠HIC1/SIRT1基因表达的实验研究

胡波12王春友3

2湖北省鄂州市中医医院；湖北鄂州436000；

3华中科技大学同济医学院附属协和医院；湖北武汉430022）

摘要：目的：观察补气通络解毒方对胰腺癌小鼠模型HIC1、SIRT1基因的影响。方法：将30只裸鼠随机分为三组，每组10只，采用癌细胞皮下种植法造模，造模成功后，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，治疗组给予补气通络解毒方灌胃，连续14天；治疗结束后，处死裸鼠，取出瘤组织，以免疫组化法检测各组标本的HIC1、SIRT1基因的表达情况。结果：在HIC1基因表达方面；治疗组阳性细胞数及灰度值明显高于模型组，二者有极显著性差异，P＜0.01，但仍然低于正常组，与正常组比较有显著性差异（P＜0.05）；在SIRT1基因表达方面：治疗组阳性细胞数及灰度值明显低于模型组，二者有极显著性差异，P＜0.01，但仍然高于正常组，与正常组比较有显著性差异（P＜0.05）。结论：补气通络解毒方通过上调模型小鼠HIC1基因表达、及下调SIRT1基因表达，从而使HIC1/SIRT1信号通路恢复平衡，发挥治疗胰腺癌的微观分子生物学效应。

关键词：补气通络解毒方；胰腺癌；HIC1/SIRT1基因

胰腺癌有“癌中之王”的称谓，是恶性程度较高的肿瘤之一,目前缺乏有效治疗手段；笔者师从邱幸凡教授多年，根据邱师关于“脏虚络痹毒结”的肿瘤发病机制[1]，结合临床，自拟补气通络解毒方治疗胰腺癌,取得了良好的临床疗效[2],为了进一步探索该方产生疗效的分子生物学机制,本人应用补气通络解毒方作用于胰腺癌模型小鼠,观察其对HIC1/SIRT1基因表达的影响，为该方治疗胰腺癌提供实验依据。

1.材料与造模

1.1.实验动物

SPF级雄性裸小鼠（BALB/C）30只，6-8周龄，体重20±2g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供；按SPF级动物实验要求进行饲养及管理。

1.2.细胞株：人胰腺癌细胞系SUIT-2，由中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所提供。

1.3.细胞培养及处理人胰腺癌细胞系SUIT-2复苏后,加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液,置于37℃,5%CO2,饱和湿度的CO2培养箱中培养。

1.4动物模型的建立

实验前观察1周,若裸小鼠生长正常(死亡率不超过10%),即分别于造模组裸小鼠左后腿外侧皮内注射SUIT-2细胞1×106个,建立移植瘤模型,而正常组（10只）则于左后腿外铡皮内注射同体积生理盐水?造模成功后将造模组随机分为模型组和治疗组、每组10只。

1．5.药物及制备

补气通络解毒方（人参5g、黄芪30g、枳壳10g、川芎15g、地龙10g、柴胡8g、蜈蚣3g、莪术15g、龙葵15g、炙甘草6g等）均按人与实验动物体表面积折算法算得小鼠等效剂量为每公斤体重60g生药。用5倍于药材的冷水浸泡20分钟，然后用武火煎至水沸，改用文火煎煮40分钟，滤出药液加冷水适量，煎至水沸，改用文煎煮30分钟，滤出药渣，将两次煎取药液混匀浓缩成每毫升含生药2g的药液，药液置于冰箱0-4℃保存。

1．6给药剂量与方法

正常组：按3ml/100g体重给予生理盐水灌胃，每日1次，连续14天。

对照组：移植癌细胞后，待移植瘤肉眼可见时，按3ml/100g体重给予生理盐水灌胃，每日1次，连续14天。

治疗组：移植癌细胞后，待移植瘤肉眼可见时，按3ml/100g体重给予补气通络解毒方灌胃，每日1次，连续14天。

1.7取材

治疗结束后，颈椎脱臼法处死小鼠,并用酒精消毒操作部位皮肤，置于超净工作台（事先以紫外线灯消毒30min），以无菌操作剥取肿瘤结节，剔除纤维包膜和坏死组织（正常组取胰腺组织），-20℃冰箱中保存。

1.8统计学分析

实验结果均以X±s表示，计量资料多组间差异性比较采用方差分析(onewayANOVA),计数资料采用卡方检验，使用spss10.0软件包进行数据处理，以P＜0.05为显著性标准。

1.9仪器试剂

切片机RM2016上海徕卡仪器有限公司

冻台JB-L5武汉俊杰电子有限公司

脱水机JJ-12J武汉俊杰电子有限公司

生物显微镜OLYMPUSCX31RTSF日本

医学图象分析系统AsBImageSys成都遨生电子有限公司

通用型免疫组化试剂盒（SABC法）批号K5007DAKO公司

HIC1、SIRT1一抗批号K5007DAKO公司

DAB显色试剂盒批号20071223武汉博士德生物工程有限公司

电子天平FC204型上海精科实业有限公司

医用冷藏箱YC-300L中科美菱

2．实验方法

2．1标本制备

将各组标本取出部分置于4%多聚甲醛中,固定3h后，依次放入15%、20%、30%蔗糖PBS液中固定,至组织下沉后冻台做冰冻切片。

2．2HIC1、SIRT1免疫组化

（1）0.1MPBS(PH=7.2,下同)冲洗5min×3次

（2）切片入1%H2O2,室温10min

（3）0.1MPBS冲洗5min×3次

（4）切片置于0.1M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)中作抗原热修复15-20min

（5）0.1MPBS冲洗5min×3次

（6）牛血清封闭,37℃30min

（7）0.1MPBS冲洗5min×3次

（8）切片加入β-内啡肽一抗,37℃24h

（9）0.1MPBS冲洗5min×3次

（10）加入二抗工作液37℃30min

（11）0.1MPBS冲洗5min×3次

（12）DAB显色

（13）自来水充分冲洗

（14）酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片

2．3图像分析

用AsBImageSys医学图象分析系统进行分析。测量各标本HIC1、SIRT1阳性基因的光密度和颗粒面积。为保证所测结果的准确性，所选待测的切片平面基本一致。每只小鼠取2张切片，每组共测10张切片，每张切片均测3个视野，3个视野所测光密度或面积之和为一个统计样本。为了使其结果更准确，采用图像分析仪对不同组别HIC1、SIRT1阳性基因的光密度和颗粒面积进行定量分析。

3．结果：见下表

4．讨论

HIC1（hypermethylatedincancer1，肿瘤高甲基化基因1）基因的主要编码产物为714个氨基酸的蛋白质，参与基因的转录调控。一般分为三个功能区域，分别是N末端约120个氨基酸残基的BTB/POZ(Broadcomplex,TramtrackandBricàbrac/PoxvirusesandZincfinger)域，参与蛋白质之间的寡聚化，同时也是一个自发转录抑制域，可以和SIRT1蛋白结合抑制SIRT1基因的转录[3]。

哺乳动物SIRT1（silencedinformationregulator，沉默信息调节因子）是酵母菌沉默信息调节因子（silencedinformationregulator，Sir2）的类似物，属于NAD+依赖性III型组蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases，HDAC）[5]。SIRT1含有275个氨基酸构成的保守催化结构域，可以对组蛋白或非组蛋白特定部位进行去乙酰化修饰，改变靶蛋白功能活性。

SIRT1在前列腺癌[6]、急性白血病[7]、结肠癌[8]、非黑色素瘤皮肤癌[9]等多种肿瘤中均存在异常高表达。ChenWY研究显示HIC1可以和SIRT1形成复合物，与SIRT1启动子结合，抑制其转录[4]；故HIC1与SIRT1之间构成了一条信号转导通路，在恶性肿瘤的发病过程中扮演重要角色。

笔者根据导师邱幸凡教授关于恶性肿瘤的“脏虚络痹毒结”的中医病机认识，自拟补气通络解毒方，方中人参味甘、微苦，微温，能大补元气，补脾益肺，为君药。黄芪味甘，性微温，为臣药，能补气生阳、益卫固表，能增强人参的补气功效，为臣药。柴胡及枳壳味辛、性温，有行气之功效；川芎、莪术味辛性温，有活血化瘀之功，故为佐药；地龙及蜈蚣辛温，能搜邪剔络，无血者走气，有血者走血，灵活迅速，《临证指南医案》：“凡虫蚁皆攻。无血者走气，有血者走血，飞者升，地行者降……”。与柴胡、枳壳、川芎、莪术配伍能引药入气络及血络，从而达到宣通络脉的功效，故为使药；龙葵性寒，味苦，微甘，具有小毒，有清热解毒之功，亦为佐药，炙甘草味甘、性微温，有调和诸药之功，故佐使药。全方合用，共奏补气通络、解毒消瘤之功。

研究结果显示：在HIC1基因表达方面，模型组最低，而正常组最高，正常组阳性细胞数及灰度值明显高于模型组，二者之间有极显著性差异，P＜0.01，而治疗组阳性细胞数及灰度值明显高于模型组，二者有极显著性差异，P＜0.01，但仍然低于正常组，与正常组比较有显著性差异（P＜0.05）；说明胰腺癌细胞中HIC1基因表达升高，经补气通络解毒方治疗后，HIC1基因表达下调，但仍没有恢复到正常水平。在SIRT1基因表达方面，模型组最高，而正常组最低，正常组阳性细胞数及灰度值明显低于模型组，二者之间有极显著性差异，P＜0.01，而治疗组阳性细胞数及灰度值明显低于模型组，二者有极显著性差异，P＜0.01，但仍然高于正常组，与正常组比较有显著性差异（P＜0.05）；说明胰腺癌细胞中SIRT1基因表达升高，经补气通络解毒方治疗后，SIRT1基因表达下调，但仍没有恢复到正常水平。综合以上数据分析，我们可以推论出：补气通络解毒方通过上调模型小鼠HIC1基因表达、及下调SIRT1基因表达，从而使HIC1/SIRT1信号通路恢复平衡，这可能是其治疗胰腺癌的微观分子生物学机制之一。

参考文献

1.倪亚、邱幸凡.补肺通络解毒法治疗肺癌的思路探讨[J].光明中医.2009，24（8）：1459-1460。

2.胡波、周贞迪、邱幸凡等.补气通络解毒方配合GEMOX方案治疗中晚期胰腺癌60例临床观察[J].北京中医药，2010.29(10):770-772。

3.NormanJ.Theroleofcytokinesinthepathogenesisofacutepancreatitis.AmericanJournalofSurgery.1998;175(1):76–83.

4.HuffmanDM,GrizzleWE,BammanMM,KimJS,EltoumIA,ElgavishA,NagyTR.SIRT1issignificantlyelevatedinmouseandhumanprostatecancer.CancerRes.2007;67(14):6612-8.

5.BradburyCA,KhanimFL,HaydenR,BunceCM,WhiteDA,DraysonMT,CraddockC,TurnerBM.Histonedeacetylasesinacutemyeloidleukaemiashowadistinctivepatternofexpressionthatchangesselectivelyinresponsetodeacetylaseinhibitors.Leukemia.2005;19(10):1751-9.

6.StünkelW,PehBK,TanYC,NayagamVM,WangX,Salto-TellezM,NiB,EntzerothM,WoodJ.FunctionoftheSIRT1proteindeacetylaseincancer.BiotechnolJ.2007;2(11):1360-8.

7.HidaY,KuboY,MuraoK,AraseS.Strongexpressionofalongevity-relatedprotein,SIRT1,inBowen'sdisease.ArchDermatolRes.2007;299(2):103-6.

8.OtaH,TokunagaE,ChangK,HikasaM,IijimaK,EtoM,KozakiK,AkishitaM,OuchiY,KanekiM.Sirt1inhibitor,Sirtinol,inducessenescence-likegrowtharrestwithattenuatedRas-MAPKsignalinginhumancancercells.Oncogene.2006;25(2):176-85.

9.NormanJ.Theroleofcytokinesinthepathogenesisofacutepancreatitis.AmericanJournalofSurgery.1998;175(1):76–83.