不同潮气量机械通气对ALI大鼠肺组织细胞凋亡影响的实验研究

陈宁1白杰1董谞楣1崔娜1王惠凌1

（1.河北大学附属医院ICU071051；2.河北保定市第三中心医院071051）

【摘要】目的研究不同潮气量机械通气对急性肺损伤（ALI）大鼠支气管和肺组织细胞凋亡的影响，并初步探讨细胞凋亡在呼吸机相关性肺损伤（VILI）中的作用机制。方法选用40只SD大鼠，制作ALI模型，随机分组：①小潮气量组（LV组）：潮气量8ml/kg，不加PEEP；②大潮气量组：潮气量30ml/kg，不加PEEP(呼气末正压)；通气2h后处死动物，留取肺标本。用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的末端标记法（TUNEL）分析肺组织中的细胞凋亡情况，用免疫组化法检测肺组织中caspase-3蛋白的表达及分布。结果大潮气量组肺组织支气管和肺组织细胞凋亡的明显增加（p＜0.01），caspase-3蛋白酶表达最强。结论小潮气量对肺组织有保护作用，细胞凋亡在VILI的发生中有重要作用。

【关键词】急性肺损伤；机械通气；细胞凋亡；caspase-3蛋白

机械通气是目前治疗急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的呼吸支持技术，但机械通气不当会诱发或加重肺损伤，称为呼吸机相关性肺损伤（VILI）[1]。近年来有关VILI的发生机制成为医学界研究的热点之一，但是其确切机制尚不完全清楚，需要进一步阐明。机械通气与细胞凋亡的研究虽然已被关注，但是有关的文献报道很少。本实验通过建立ALI的动物模型，分别应用不同潮气量8ml/kg和30ml/kg进行通气治疗，观察肺组织细胞凋亡情况，探讨潮气量对肺组织的影响。

1资料和方法

1.1ALI动物模型的建立

健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，体重270～320g（购自河北大学实验动物中心）。术前称重，将各组大鼠用10%水合氯醛腹腔内注射麻醉后，取仰卧位，置于手术台上。分离颈动脉、颈静脉；行动脉、静脉插管，以备测血气。应用静脉内注射油酸制作急性肺损伤模型，剂量为0.1ml/kg，用1ml微量注射器抽取进行静脉注射，静脉注射后3～5min，大鼠呼吸增快、鼻翼煽动、呼吸费力、口腔黏膜和四肢末梢紫绀。抽取动脉血气以氧合指数PaO2/FiO2≤300，作为急性肺损伤模型成功的指标。模型建立后分离气管，气管切开插管，连接动物用呼吸机(成都泰盟HX-300S型动物呼吸机)。

1.2机械通气

40只大鼠随机分为2组（n=20），①小潮气量组（LV组）：潮气量8ml/kg；不加PEEP；②大潮气量组：潮气量30ml/kg；不加PEEP。各组大鼠除潮气量设置外，呼吸频率小潮气量组：70次/分，大潮气量组：50次/分；吸呼比（I:E）：1：2，FiO2为1.0。

1.3标本采集

通气2h后，经动脉插管放血处死大鼠后，立即开胸取出完整的肺组织，用滤纸吸干血污。取左肺中部肺组织，用多聚甲醛固定，石蜡和环氧树脂包埋，作病理切片。

1.4采用TUNEL法原位检测肺组织细胞凋亡

用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的末端标记法（TUNEL）分析肺组织中的细胞凋亡情况，通过原位测定肺组织切片中的DNA片段对损伤的肺组织中细胞凋亡的程度进行评价。TUNEL分析试剂盒购自德国宝灵曼公司。步骤如下：切片常规脱蜡脱水，用蛋白酶K37℃孵育15min；随后滴加50ul的TUNEL反应混合溶液，在湿盒中37℃孵育60min；再加入50ul转化剂-POD，在湿盒中37℃孵育30min；加入50～100μlDAB底物溶液，室温孵育10min，苏木素复染细胞核，封片。细胞棕黄色染色者为阳性细胞，在400倍光镜下每张切片以随机数字表法随机观察10个高倍视野。计算每高倍视野中阳性细胞数和该高倍视野中细胞总数的比值，以百分数表示，即凋亡指数（apoptosisindexAI）。

1.5免疫组化法检测肺组织中caspase-3蛋白的表达

兔抗caspase-3抗体购于北京中山生物技术公司。滴加一抗后，4℃过夜，同时用PBS代替一抗而其他条件均相同作阴性对照，滴加二抗后37℃20min，然后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木精复染封片。caspase-3阳性细胞胞浆呈棕黄色，每张组织切片取5个高倍视野，计数阳性细胞总数，取其均值，以阳性细胞数/高倍视野表示。

1.6统计学处理

采用SPSS11.5统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若p＜0.05认为有统计学意义，进一步进行SLD-t检验，若p＜0.05认为差异显著。

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图1LV组TUNEL分析结果（400×）

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图2LV组caspase-3蛋白在支气管上皮的表达（400×）uC,RichardsonJA,etal.AdultApaf-1-deficientmiceexhibitmaleinfertility[J].DevBiol,2000,218(2):248-258.

2结果

2.1TUNEL分析结果

LV组有少量的阳性细胞，主要分布在肺泡腔内侧和肺泡隔。HV组部分肺组织结构紊乱，有较多的阳性细胞，分布在肺泡间隔内的阳性细胞数量明显增加，同时在支气管上皮也可以见到较多的阳性细胞。

2.2Caspase-3蛋白的表达

LV组阳性细胞数较少，主要在血管内皮和细支气管上皮细胞胞浆出现弱阳性染色；HV组阳性细胞数明显增加，多分布在支气管上皮、血管内皮，尤以支气管上皮细胞明显，与LV组比较有显著性差异（p＜0.05）。

表1各组动物细胞凋亡指数和

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注：﹡示与LV组比较p＜0.05，

3讨论

近年来的研究认为，细胞凋亡在急性肺损伤死亡的细胞中占有很大的比例，特别是在急性肺损伤的早期，细胞凋亡是肺泡上皮细胞死亡和溶解清除的主要方式。机械通气引起的肺组织细胞的凋亡的文献报道较少，目前主要认为凋亡主要发生在机械通气的早期，而刺激因素持续较长时间后，细胞凋亡的数量和比例则开始下降，而细胞坏死的数量和比例则开始上升。有人认为坏死的增加是继发于凋亡的结果。Hammerschmidt[2]实验证实，以较大的幅度牵拉（表面积增加30%）体外培养的大鼠Ⅱ型上皮细胞与较小幅度牵拉（表面积增加13%）比较，细胞凋亡指数增加7%。推测过度牵拉可以直接造成肺泡上皮细胞的凋亡。而在Fisher[3]和Imai[4]的报道中低程度的损伤性机械通气时，肺组织细胞的凋亡的数量增加，而高程度的损伤性机械通气时，细胞凋亡的数量却下降。胡国栋等[5]研究发现，随着潮气量的增加，细胞凋亡的数量也明显增加，但是肺泡上皮细胞的凋亡数量并没有明显增加。本实验中也发现，大潮气量通气的凋亡阳性细胞指数明显增加，主要分布在肺泡间隔和支气管上皮细胞，与前面实验不完全相同。考虑本实验是在油酸急性肺损伤的模型基础上再行机械通气（属“二次打击”模型），而且通气时间较短，均在ALI及VILI的早期，因此造成更多的肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞的凋亡。

机械牵拉调节肺组织细胞的结构和功能的机制是多因素的。随着分子生物学技术的发展，从分子水平ALI时肺内细胞的调控进行了深入的研究，各种刺激信号如LPS、TNF-α、DNA损伤、病毒感染等始动凋亡，凋亡信号经Fas/Fas-Apo-1，TNF-α/TNF-αR1、鞘磷脂酶/神经酰胺等传导途径传入细胞内，有Bcl-2蛋白家族、细胞色素C和caspase等参与调控执行。Caspase为半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶简称，是一组具有相似的氨基酸顺序、二级结构的半胱氨酸蛋白酶，与真核细胞的凋亡密切相关，还参与细胞因子的成熟、细胞成长和分化。在caspase-3―／―小鼠的研究发现，在Fas诱导下，与凋亡有关的形态学变化如染色质凝集、细胞皱缩、线粒体肿胀和凋亡小体的形成，明显缺乏和延迟出现，提示caspase-3参与细胞凋亡的较晚阶段[7]。为了了解是否caspase-3也是引起VILI中细胞凋亡的机制，用免疫组化法研究了caspase-3在肺组织的表达和量的变化。结果表明，capase-3的表达多分布在支气管上皮和血管内皮细胞，肺泡上皮细胞表达很少，HV组表达最强。可能由于大潮气量造成气道压的升高，支气管上皮细胞受到牵拉的刺激，同时大潮气量血清和BALF中的TNF-α浓度均最高，多种因素激活了caspase的级联反应，加速了细胞的凋亡。但是与TUNEL的结果不相符的是各组肺泡上皮细胞阳性表达均较少，考虑肺泡上皮细胞凋亡机制是否主要是其他途径，需要进一步的研究。

总之，在肺损伤的情况下，大潮气量机械通气可以造成肺脏的进一步损害，肺组织细胞凋亡的数量增加，而小潮气量有一定的肺保护作用。本研究发现细胞凋亡在VILI的发病机制中有重要作用，caspase-3蛋白酶的表达表明一部分细胞的凋亡是通过此途径来完成的，同时本实验也发现，是否在肺组织的细胞凋亡的过程中还存在其他的调控基因值得进一步研究。

参考文献

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[3]FischerS,CassiviSD,XavierAM,etal.Celldeathinhumanlungtransplantation:apoptosisinductioninhumanlungsduringischemiaandaftertransplantation[J].AnnSurg,2000,231(3):424-431.

[4]ImaiY,ParodoJ,KajikawaO,etal.Injuriousmechanicalventilationandend-organepithelialcellapoptosisandorgandysfunctioninanexperimentalmodelofacuterespiratorydistresssyndrome[J].JAMA,2003,289(16):2104-2112.

[5]胡国栋,蔡绍曦,陈英华,等.不同潮气量机械通气对大鼠支气管和肺组织细胞凋亡的影响[J].第一军医大学学报,2005,25(3):508-512.

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[7]TheAcuteRespiratoryDistressSyndromeNetwork:Higherversuslowpositiveend-expiratorypressureinpatientswiththeacuterespiratorydistresssyndrome[J].NEnglJMed,2004,3(51):327-336.

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