伤科消肿颗粒的急性毒性与长期毒性实验研究

李海英梁丽英（通讯作者）

【摘要】目的：观察伤科消肿颗粒的急性毒性及长期毒性可能造成对机体的毒性反应，为临床提供安全依据。方法：用25g/kg的剂量灌胃小鼠进行毒性实验，观察小鼠的一般情况；用2.5g/kg、5g/kg、10g/kg每天灌胃大鼠，连续给药180天，停药后观察药物对大鼠生长发育以及血常规、血液生化指标、主要脏器病理形态影响。结果：急性毒性实验小鼠无一死亡；小鼠1天内灌胃伤科消肿颗粒最大耐受量75g/kg；长期毒性实验结果显示，伤科消肿颗粒对大鼠生长发育以及血常规、血液生化指标、主要脏器病理形态与空白对照组比较均无明显差异。结论：伤科消肿颗粒临床拟用量是安全的。

【关键词】消肿颗粒；急性毒性；长期毒性；实验研究

【中图分类号】R99【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）34-0084-03

骨折后肿胀，如不及时处理轻则影响皮肤肌肉组织的愈合，重则引起肌间隔综合症。所以处理骨折后的肿胀刻不容缓，中医在骨折早期普遍观点认为肿胀属于“瘀血”，“水肿”的范畴，病机为损伤而致气滞血瘀，水瘀互结；治当活血祛瘀，利水消肿，即“活血利水”观点。我院骨二科在此理论的基础上，根据肺能通调水道，脾能助胃运化水谷，运化体内水湿，升举清阳，统摄血液的功能，研究出了“伤科消肿方”。此方由土鳖虫、赤芍、泽兰、车前子、粉防己、桔梗等15味药组成，诸药配合可迅速达到活血止痛利水消肿之功。它在活血利水的基础上更加突出宣肺健脾新的中医观点，于是消肿止痛更加迅速[1]，伤科消肿方已经成为我院骨二科在消肿止痛上的经验方，但无成熟的剂型，远远不能满足广大骨折术后肿胀患者的要求。因此有必要将“伤科消肿方”按照《医疗机构制剂注册管理办法》的有关要求，进行颗粒剂工艺的研制，建立质量控制标准，进行颗粒剂稳定性试验，主要药效学试验、毒性试验等为临床提供一个安全有效的新制剂。本实验主要是观察伤科消肿颗粒的急性毒性及长期毒性可能造成对机体的毒性反应，为临床提供安全依据。

1.实验材料

1.1实验药物

1.1.1药物伤科消肿颗粒:中药复方制剂，组方为：土鳖虫15g、赤芍15g、泽兰10g、车前子10g、益母草10g、粉防己15g、金银花15g、连翘10g、薄荷5g（后下）、柴胡10g、桔梗10g、枳壳10g、黄连3g、茯苓10g、甘草5g。(由本院制剂中心制备成伤科消肿颗粒)，以蒸馏水配制成40%混悬液供动物灌胃使用。

1.1.2伤科消肿颗粒性状为褐色粉末，气微香，味微苦。

1.2实验动物

1.2.1动物昆明种小鼠40只，体重20～22g，雌雄兼用[广西医科大学实验动物中心提供(医动字第08-004号)]；Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，其中雄性40只，雌性40只，体重:120g，[广西医科大学实验中心提供](医动字第08-004号)

1.2.2饲养条件雌、雄分笼饲养，饲养于独立笼内，室温(23～25度，湿度40%～60%，人工控制光照昼夜各12h。自由饮水。实验开始前饲养观察1周。

1.3实验仪器

日立7600-020ISE型全自动生化分析仪(日本日立公司)；A-12456型血液分析仪(日本希森美康公司)；病理图文分析系统（日本奥林巴斯公司）；SL-202型电子天平(上海)；5804R低温高速离心机（德国德国eppendorf公司）；三用电热恒温水温箱（上海跃进医疗器械厂）

2.实验方法

2.1急性毒性实验

2.1.1半数致死量(LD50)的测定根据孙氏综合法，首先进行预试实验，算出D0和D100。在D0和D100的剂量范围内设5个剂量组，组间剂量比值1:0.8，观察一次给药后7d内动物死亡情况，计算LD50。如LD50>10.0gkg则为实际无毒

2.1.2最大耐受量测定(安全限度试验)由于伤科消肿颗粒无法测出D100，而且样品溶解度不能进一步提高，以及每只小鼠每次灌服的体积不能超过0.5ml，所以伤科消肿颗粒改为测定最大耐受量[2]。根据临床应用剂量成人日用总量为30g(成人体重按60kg计算，单位体重人用剂量为30g/60kg=0.5g/kg)，按人的50倍用量，每次灌胃的浓度为25g/kg，将小鼠随机分成4组，每组20只，每组动物在1d时间内灌服相同浓度的伤科消肿颗粒，灌服次数不同。按照分组情况，每隔3h增加一次，观察7d内动物的中毒反应或死亡情况。计算出最大耐受量及耐受量倍数。以耐受人用量口服100倍以上为安全。

2.2长期毒性实验

动物适应环境饲养1周，经笼旁观察动物精神、活动、饮食、大小便等生理活动正常、雌性无孕后，按性别随机分为对照组、伤科消肿颗粒小、中、大3个剂量组，每组20只(雌、雄各半)，分笼饲养。根据临床应用剂量成人日用总量为30g(成人体重按60kg计算，单位体重人用剂量为30g/60kg=0.5g/kg)。结合实验可操作性，按以下剂量给药：小剂量组：伤科消肿颗粒2.5g/kg，相当于临床拟用剂量5倍；中剂量组：伤科消肿颗粒5g/kg，相当于临床拟用剂量10倍；大剂量组伤科消肿颗粒10g/kg，相当于临床拟用剂量20倍；对照组：给予等容量生理盐水。每天灌胃1次(每周日不给药)，连续用药6个月，采样后进行血液学、血液生化指标测定，并进行系统尸体解剖观察，取主要脏器称重、计算脏/体比系数，对主要脏器进行病理组织学检查[3-4]。

2.3统计处理

采用SPSS17.0软件对数据进行分析，计量资料以x-±s表示，采用单因素方差分析，方差不齐时采用秩和检验，组间两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3.实验结果

3.1最大耐受量测定

给小鼠灌服第3次药物时，动物死亡数量为0；3h后，再灌服一次，则动物死亡数量为2。因此，以25g/kg、连续3次的剂量为小鼠的最大耐受量。计算出小鼠对伤科消肿颗粒的最大耐受量是75g/kg，为临床用药量的150倍(人体以60kg体重计，最大临床用30g，即人临床用药量为0.5g/kg），属于无毒物。

3.2伤科消肿颗粒对动物一般体征及体重的影响

伤科消肿颗粒给药期间，各组动物饮食、活动、生长发育、二便均正常，精神状态良好，毛色光滑，各组均未出现死亡动物。试验期间动物体重增长良好，小、中、大剂量组动物的体重与对照组比较无明显差异。

3.3伤科消肿颗粒对血液学指标的影响

结果见表2，伤科消肿颗粒3个剂量组与对照组比较，HB、RBC、PLT、WBC总数等均无显著性差异(P＞0.05)。

3.4伤科消肿颗粒对血液生化学学指标的影响（x-±s）

结果见表3，伤科消肿颗粒3个剂量组与对照组比较，总数等均无显著性差异(P＞0.05)。见表3。

3.5病理组织学检查

按系统解剖取各剂量组和对照组各10只大鼠的心、肝、脾、肺、肾等组织，进行病理组织学检查，各剂量组和对照组各脏器组织学均未发现明显病理性改变。脏器细胞未见变性坏，细胞质内未见色素集聚。骨髓图片镜下观察可见，伤科消肿颗粒给药组和正常组大鼠骨髓增生极度活跃，细胞大小、形态正常。

4.讨论

本研究按照国家相关中药新药研发要求，采用动物急性、长期毒性实验方法评价了伤科消肿颗粒安全性。结果显示，急性毒性实验中无法测出该药LD50，用最大耐受量方法测得伤科消肿颗粒对小鼠最大耐受量是75g/kg，为临床用药量的150倍(人体以60kg体重计，最大临床用30g，即人临床用药量为0.5g/kg），表明本品毒性较低，安全范围大，为临床安全应用提供了科学依据。

长期毒性实验结果表明，本品大中剂量组雄性动物的体重及白细胞总数稍有影响，但与对照组相比无明显差异，这可能是由于每次给动物药量体积较大，致使食量减少，体重及机体抵抗力暂时下降所致，不属于本品所致的病理性改变。对其血液指标、血液生化指标及肝、肾功能无明显影响；其心、肝、脾、肺、肾等主要脏器组织未发现明显病理性改变。大鼠连续灌胃6个月，给药组和正常组大鼠骨髓增生极度活跃，细胞大小、形态正常。上述试验结果表明，采用相当于临床用药剂量20倍的接骨丹胶囊给大鼠灌胃连续用药6个月，未发现明显药物所致的毒副反应。由此预测，接骨丹胶囊临床用药是安全的。

由于此方是建立在全新的中医观点上，在多年的临床应用中，我院骨二科刘武博士等人对此方的有效性进行了进一步研究，研究证实该方与七叶皂苷钠比较具有可比性，对四肢骨折术后具有利水消肿的临床效果[1]。在临床观察方面刘武博士等也对320例骨折术后肿胀患者做了回顾性的研究，结果表明：该方在改善患者肿胀程度、对缓解疼痛、预防并发症等方面有确切的临床效果。尽管“伤科消肿方”具有很好的疗效，并且已经成为我院骨二科在消肿止痛上的经验方，但无成熟的剂型，远远不能满足广大骨折术后肿胀患者的要求。因此有必要将“伤科消肿方”按照《医疗机构制剂注册管理办法》的有关要求，进行颗粒剂工艺的研制，建立质量控制标准，进行颗粒剂稳定性试验，主要药效学试验、毒性试验等为临床提供一个安全有效的新制剂，并整理研究资料申请医院制剂批准文号。制成伤科消肿颗粒剂后，在消肿止痛的剂型方面也克服了汤剂服用、携带不便，片剂服用片数过多、吸收慢，加上毒胶囊的出现等其他剂型存在的不足，并将填补我院院内制剂无治疗骨折、外伤后肿胀口服产品的空白。

【参考文献】

[1]刘武，米琨，王斌，俸志斌，刘鹏飞，欧伦，伏春华，王瑞华.活血利水法治疗四肢骨折术后肿胀疗效观察[J].新中医杂志，2011，43(9):59-60.

[2]刘建卫，毕业东，范英昌，姜希娟，高青，郭茂娟，苏金玲.护肝中药“五田保肝液”急性毒性实验研究[J].天津中医药大学学报，2015，01:27-29.

[3]高晓东，李雪萍，徐春茂，刘宝录，王晓蕾，管国倩，李建银.扶正逐毒丸制剂大鼠长期毒性实验研究[J].中国临床药理学杂志，2015，07:563-565.

[4]李冬梅，沈丹，何慧丽，仲华.脑心舒软胶囊对大鼠的长期毒性实验研究[J].医学研究杂志，2014，10:151-153.