西达本胺对K562/G01细胞增殖抑制、凋亡及Hedgehog信号通路相关机制的研究

邹皓

摘要：目的：探讨西达本胺（Chidamide）对K562/G01增殖抑制、诱导凋亡作用及机制。方法：不同浓度的西达本胺作用于K562/G01细胞，观察细胞形态，检测增殖抑制率、凋亡率，检测Gli1、CyclinD2、BCR/ABLmRNA及蛋白和组蛋白H3表达情况。结果：西达本胺对K562/G01细胞的增殖抑制具有剂量-时间依赖性，凋亡率呈剂量依赖性，并可下调BCR/ABL、Gli1、CyclinD2mRNA及蛋白，上调组蛋白H3表达。结论：西达本胺对K562/G01细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用与抑制BCR/ABL基因、组蛋白H3乙酰化修饰及Hedgehog信号通路有关。

关键词：西达本胺；K562/G01；BCR/ABL；Gli1；CyclinD2

1材料与方法

1.1实验药品

西达本胺由深圳微芯生物科技有限责任公司提供，DMSO溶解后培养液稀释。

1.2细胞株与细胞培养

K562/G01细胞株是人伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病细胞株，由中国科学院血液病研究所赞助。细胞复苏后在37℃、5%CO2、湿度饱和的培养箱培养，每2-3日观察细胞生长情况及更换培养液。

1.3检测增殖抑制率

调整对数期细胞密度为2×105/ml，加药组（2.5、5、10、30、60μmol/l）及对照组（等量培养液）分别接种96孔板。20h、44h、68h时避光加MTT液（20μl/孔），4小时后加DMSO（150μl/孔）。酶标仪检测吸光度值，计算增殖抑制率。SPSS20.0软件计算IC50值。

1.4观察细胞形态

依IC50值选择西达本胺浓度：10，30μmol/l。调整细胞密度2×105/ml，同前接种6孔板，培养72h。离心甩片，姬姆萨染色后显微镜下观察细胞形态。

1.5检测凋亡率

调整细胞密度2.5×105/l，等体积种植于培养瓶，加药，培养48、72h，凋亡试剂盒处理细胞后流式细胞仪检测凋亡率。

1.6检测基因表达量

同前种植并收集细胞。提取细胞总RNA，按照反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，扩增BCR/ABL、Gli1、CyclinD2mRNA，以人GAPDH为内参，NCBI数据库里面查找BCR/ABL、Gli1、CyclinD2基因DNA序列，primerpremier5.0软件设计引物。GAPDH上游引物5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’，下游引物5’-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3’，片段长度120bp；BCR/ABL上游引物5’-AATGCCGCTGAGTATCTGCT-3’，下游引物5’-GCCATCAGAAGCAGTATTGA-3’，片段长度144bp；Gli上游引物5’-GTGCAAGTCAAGCCAGAACA-3’，下游引物5’-ATAGGGGCCTGACTGGAGAT-3’，片段长度162bp；CyclinD2上游引物5’-ATTGAACCATTTGGGATGGA-3’，下游引物5’-ATGGTGGTGTCTGCAATGAA-3’，片段长度227bp。反应条件94℃变性10min，60℃退火60s，94℃延伸15s，循环45次。上机检测。计算基因X相对于GAPDH表达量，公式：。

1.7检测蛋白表达

同前种植并收集细胞。提取总蛋白，经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭及抗体孵育后放入活体成像仪，曝光5min，截图。

1.8统计学处理

所有数据以均数±标准差表示，组间均数比较采用析因方差分析与单因素方差分析，P<O．05时差异有统计学意义。数据采用SPSS20.0软件、GraphPadPrism4．O软件分析。

2结果

2.1西达本胺对K562/G01的增殖抑制作用

表1西达本胺对K562/G01细胞的增殖抑制率（±s，%，n=3）

增殖抑制率随着时间延长、浓度增加而增高，比较有统计学差异（p<0.05），具有剂量-时间依赖性。24h、48h、72h的IC50值为27.65μmol/l、13.28μmol/l、5.56μmol/l。见表1。

2.2西达本胺处理K562/G01细胞形态学改变

对照组细胞（0μmol/l）均匀饱满、边界清晰、形态完整。加药组细胞（10μmol/l、30μmol/l）出现了凋亡现象，30μmol/l时凋亡细胞数明显增多，胞内空泡更多，胞膜更不规则，细胞核碎裂、溶解现象更明显。

2.3西达本胺诱导K562/G01细胞凋亡作用

西达本胺组的早期凋亡率及晚期凋亡率均高于对照组（p<0.05），且30μmol/l浓度组凋亡率明显大于10μmol/l（p<0.05）。提示西达本胺可诱导K562/G01细胞出现凋亡。见表2。

表2西达本胺作用于K562/G01细胞的凋亡率（±s，%，n=3）

3讨论

研究发现酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）可消除大多数BCR/ABL阳性祖细胞，但仅局限于分化的CML祖细胞，因静止未分化的CML祖细胞及BCR/ABL阳性干细胞对IM不敏感，具有抗药性[1]。大量实验证实，HDACi单药或与TKI联合使用可诱导CML-BC期细胞、耐IM的静息CML祖细胞、干细胞凋亡，增强酪氨酸激酶抑制剂的抗肿瘤作用，降低BCR-ABL表达水平[2，3]。本实验表明西达本胺对K562/G01细胞的增殖抑制为时间-剂量依赖性，西达本胺浓度与BCR/ABLmRNA、蛋白表达量负相关，且随药物浓度增加，表达量逐渐减少，证实该药可以有效抑制BCR/ABL蛋白和基因，这与文献结果一致[2，3]。

国内吴荣娟等[4]研究说明K562/G01细胞对HDACi的剂量依赖性作用是通过下调凋亡相关蛋白诱导细胞凋亡。本课题也证实西达本胺可诱导K562/G01细胞凋亡，具体剂量依赖性，与吴氏结果相似。WesternBlot法检测了组蛋白H3发现随药物浓度的增高，组蛋白H3表达水平亦有所增高，并可降低BCR/ABL水平，验证了西达本胺在慢性粒细胞白血病也是通过上调组蛋白H3乙酰化作用发挥抗肿瘤的功效，提示BCR/ABL表达水平是与组蛋白乙酰化状态密切相关。这与文献研究相似[5]。Zhang等对HDACi联合IM作用IM耐药的CML时发现，发现HDACi单药只有达到高浓度时才能发挥疗效[3]，研究中认为，HDACi本身对CML-CP期细胞的凋亡影响很小，主要是通过抑制BCR/ABL酪氨酸激酶活性发挥作用的，本实验结果与其相反，可能是HDACi选择剂型差异。

Li和zhang认为HDACi联合IM通过抑制维持造血干细胞存活的基因达到诱导LSC凋亡的目的[3]。Hedgehog信号通路对造血系统干细胞的自我更新至关重要[6]，而且受组蛋白乙酰化调控[7]。GLi1是Hedgehog信号通路激活的标志[8]。CyclinD2为GLi的下游基因，受Gli的调控，可加速细胞从G1期进入S期，细胞过度增殖[9]。另外，CyclinD2也与BCR/ABL激酶活性的异常表达有着密切的关系，可促进BCR/ABL表达上调，促进了CML细胞的过度增殖[10]。本实验研究显示GLi1、CyclinD2在K562/G01细胞中高表达状态，随西达本胺浓度增高，GLi1、CyclinD2表达量逐渐下降。证实在伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病细胞株中Hedgehog信号通路是活化状态，其可能参与了CML的发生及对伊马替尼的耐药，采用西达本胺乙酰化作用可抑制Hedgehog信号通路诱导白血病细胞凋亡。

综上所述，我们可得出BCR/ABL基因异常表达、组蛋白乙酰化修饰、Hedgehog信号通路均参与了CML对伊马替尼的耐药形成，西达本胺对K562/G01细胞诱导凋亡机制可能主要通过组蛋白H3乙酰化发挥作用，直接或间接调控Hedgehog信号通路发挥抗肿瘤作用。

参考文献：

[1]CorbinAS，AgarwalA，LoriauxM，etal.HumanchronicmyeloidleukemiastemcellsareinsensitivetoimatinibdespiteinhibitionofBCR-ABLactivity[J].JournalofClinicalInvestigation，2011，121（1）：396-409.

[2]JinY，YaoY，ChenL，etal.Depletionofgamma-cateninbyHistoneDeacetylaseInhibitionConfersEliminationofCMLStemCellsinCombinationwithImatinib[J].Theranostics，2016，6（11）：1947-1962.

[3]ZhangB，StraussAC，ChuS，etal.Effectivetargetingofquiescentchronicmyelogenousleukemiastemcellsbyhistonedeacetylaseinhibitorsincombinationwithimatinibmesylate[J].CancerCell，2010，17（5）：427-442.

[4]吴荣娟，黄轶群，马旭东.异硫氰酸苯己酯诱导伊马替尼耐药K562/G01细胞株凋亡的组蛋白调控机制研究[J].福建医科大学学报，2012（06）：380-384.

[5]陈曙平.曲古抑菌素A对伊马替尼耐药慢性粒细胞白血病细胞的研究[D].中南大学，2012.

[6]TrowbridgeJJ，ScottMP，BhatiaM.Hedgehogmodulatescellcycleregulatorsinstemcellstocontrolhematopoieticregeneration[J].ProcNatlAcadSciUSA，2006，103（38）：14134-14139.

[7]孙婧，菅天孜，王珂，等.Hedgehog信号通路临床研究进展[J].医学综述，2017（04）：625-628.

[8]CarpenterRL，LoHW.HedgehogpathwayandGLI1isoformsinhumancancer[J].DiscovMed，2012，13（69）：105-113.

[9]ClementV，SanchezP，deTriboletN，etal.HEDGEHOG-GLI1signalingregulateshumangliomagrowth，cancerstemcellself-renewal，andtumorigenicity[J].CurrBiol，2007，17（2）：165-172.

[10]宋俊敏，徐冬，范尔进，等.慢性粒细胞白血病cyclinD2基因的表达研究[J].中华血液学杂志，2004（02）：42-44.

注：基金项目：山西省科技成果转化引导专项基金（201604D131005）山西省回国留学人员基金（2017-126）