大鼠小体积肝移植术后炎症因子的变化研究

田国东1胡明政1王学浩2

【摘要】目的在小体积肝移植模型中，通过观察肝组织内多种细胞因子的变化和中性粒细胞浸润情况来探讨小移植物的损伤机制。方法建立大鼠小体积肝移植模型，分别在再灌注后3h，6h，12h，24h和48h处死取材。结果小体积肝移植后，(1)血浆ALT、AST迅速升高并在再灌注12h后达到最高峰；（2）在肝组织中损伤性细胞因子TNF-α和IL-6的浓度在移植的早期和后期分别出现一次高峰，而血浆中的TNF-α、IL-6则仅在移植早期升高后便逐渐下降；（3）肝组织中无论是保护性细胞因子HO-1、eNOS、iNOS,还是损伤性因子ICAM-1都是呈现在移植的早期出现一过性升高便迅速下降；（4）在肝组织血管附近区域，中性粒细胞在后期明显浸润；在肝实质中，中性粒细胞浸润与早期相比，无明显差异。结论在大鼠小体积肝移植中，造成移植物的损伤在缺血再灌注损伤的急性期主要是炎症因子介导，而在亚急性期，不仅与炎症因子的升高有关，可能还与中性粒细胞的浸润有关。

【关键词】小体积；肝移植；大鼠；中性粒细胞；细胞因子

肝移植是终末期肝病最主要的治疗方法之一【1】，随着活体肝移植和劈离式肝移植的广泛开展，由于供肝体积受限而产生的“小肝综合症”逐渐成为限制其发展的重要因素.【2】目前对小体积肝移植早期的不同阶段造成移植物损伤的原因并不十分清楚，本研究将小体积肝移植早期（再灌注48以内）分为急性损伤期（再灌注后1-12小时）和亚急性损伤期，观察不同阶段多种细胞因子的变化和中性粒细胞的浸润情况并试图探讨其损伤机制。

材料和方法

1．动物及分组

55只SD雄性大鼠(8–12周龄，体重250–300g；购自中国北京维通利华实验动物中心)随机取5只作为假手术组（只进腹不行移植术），其余50只随机配对作为供受体进行小体积肝移植术，然后随机分别在移植术后(以肝脏复流时间为准)3小时、6小时、12小时、24小时和48小时各取5只模型处死，收集血清和肝组织液氮保存备用，部分肝组织用10%福尔马林固定后石蜡包埋备用。

2．实验方法

2.1小体积肝移植模型的建立：供体全肝移除后行原位尾叶、左叶、右叶和三角叶切除，留取中叶置于灌注保存液中保存备用。在受体小鼠肝移除后，供肝中叶原位移植入肝脏腔隙内。术后适量补充林格液体，复苏后单笼饲养。动物模型自然存活，凡术后2天内死亡者视为手术失败，并探查死亡原因（肉眼判断），大于7天的视为长期生存。

2.2肝功能测定：采用全自动生化分析仪测定血清丙氨酸转氨酶（ALT）和门冬氨酸转氨酶（AST）。

2.3组织检查；常规病理（HE染色）和中性粒细胞特殊染色（naphtholAS-Dchloroacetateesterase染法，试剂盒购自，按其说明书操作），切片水溶性封片剂封片，显微镜观察。

2.4western-blotting测定一氧化氮合酶的蛋白表达。

2.5western-blotting法对一氧化氮合酶行蛋白水平检测，FluorChem5500，AlphaInnotech捕获图象，计算相对蛋白含量。

2.6统计学方法：采用Stata9.2软件进行分析。

实验结果

1．肝功能的检测

我们使用全自动生化仪检测了小体积肝移植后多个时点动物血浆中的ALT和AST，发现在小体积肝移植后，血浆ALT和AST迅速升高，并在再灌注后12小时达到最高峰，然后下降。

2．组织学观察

3．肝组织中部分再灌注损伤保护性因子的变化

在缺血再灌注损伤机体应激时有大量的细胞保护因子参与了这一过程，我们选取了一氧化氮合酶（包括诱导型和内皮型）、血红素氧合酶-1和抗凋亡基因Bcl-2进行观察。

4．肝组织和血浆中白介素-6和肿瘤坏死因子-α的变化

白介素-6和肿瘤坏死因子-α在肝脏缺血再灌注损伤中是两个重要的损伤性细胞因子，他们介导了机体的炎症反应，造成靶器官的损害，我们利用Elisa法分别对小体积肝移植模型的外周血浆和肝组织中的白介素-6和肿瘤坏死因子-α进行测定。

讨论

在肝脏缺血再灌注中，亚急性期的缺血再灌注损伤主要是由中性粒细胞介导的，有研究表明西维来司在肝缺血再灌注损伤过程中能抑制中性粒细胞在肝血管内皮细胞的黏附和迁徙，在再灌注12h后能明显降低血清肝酶水平从而抑制肝损伤。中性粒细胞的浸润导致血管壁损伤，影响组织微循环而加重炎症反应和组织结构的破坏。我们在小体积肝移植中也发现，与急性期相比较，在其缺血再灌注损伤的亚急性期，中性粒细胞浸润更加明显，特别是血管附近区域，而且肝窦间隙扩张。同时，尽管外周血中的IL-6和TNF-α是在不断地降低，但肝组织中的IL-6和TNF-α却再次升高，并且此时一些保护性因子在肝脏中的表达仍然在继续降低。而相关文献表明，在大鼠小体积肝移植中，模型死亡的高发期正是在再灌注48小时至96小时之间，因此，中性粒细胞的浸润和促炎因子的再度升高引起的肝脏亚急性期的损伤可能是导致小体积肝移植后“小肝综合症”的主要原因之一。

结论

在大鼠小体积肝移植中，造成移植物的损伤在缺血再灌注损伤的急性期主要是炎症因子介导，而在亚急性期，不仅与炎症因子的升高有关，可能还与中性粒细胞的浸润有关。

参考文献

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