HPLC 法测定血再生片中 丹参酮Ⅱ A的含量

葛涵 王美多

摘要：目的：建立血再生片中丹参酮Ⅱ_A的含量测定的方法。方法：采用HPLC法，选用色谱柱：资生堂C₁₈（4.6 mm×250 mm,5 μm），甲醇-水（80∶20）为流动相，检测波长为:270 nm，流速为1.0 mL/min，柱温：30℃。结果：线性范围为A=0.1824—1.2748µg

r=0.99999（n=6），平均回收率为96.60％，RSD%=1.54%。结论：本方法操作简便，灵敏度高，可用于血再生片中含量测定的质量控制。

关键词：血再生片；丹参酮Ⅱ_A；高效液相色谱法；含量测定；

血再生片由丹参、当归、熟地黄3味中药制成，收载于卫生部《药品标准中药成方制剂》第八册中。具有活血补血的功效， 用于慢性苯中毒引起的白细胞减少症^[1]。现有质量标准中尚未有定量测定研究，不能很好地控制片剂的质量，为确保药品质量，本试验选用HPLC法对血再生片中丹参的有效成分丹参酮Ⅱ_A进行含量测定，为质量标准的制定提供一定依据。

1.仪器与设备

样品：血再生片（生产单位：广州；批号为：190601，190602，190603）；对照品：丹参酮Ⅱ_A（供含量测定用，生产单位：中国食品药品检定研究院，批号：110726-201011）；甲醇（色谱纯，生产单位：天津市康科德科技有限公司），水为去离子水；其它试剂均为分析纯。Agilent1260 Series高效液相色谱仪、ChemStation工作站（Agilent科技有限公司）；MS105DU电子分析天平（美国梅特勒,十万分之一）。

2.方法与结果

2.1 色谱条件的选择^[2]

色谱柱：资生堂C₁₈（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流动相：甲醇-水（80：20，V/V）；检测波长：270nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10µL。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备

精密称定对照品丹参酮Ⅱ_A，加甲醇制成每1mL含0.0921mg的溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

取同一批样品10片除去糖衣后，研细混匀，精密称定0.2g，置锥形瓶中，加入80%乙醇50mL，加热回流提取3次，每次1h，滤过，合并三次提取液，浓缩至10mL溶液，摇匀，滤过，取续滤液。

2.2.3阴性样品溶液制备

按处方比例及生产制备方法，制备不含丹参药材的阴性样品，照上述供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按确定的色谱条件进样测定。结果色谱行为良好，丹参酮Ⅱ_A与其它组分色谱可达基线分离，且与相邻色谱峰分离度大于1.6；理论板数按对照品丹参酮Ⅱ_A峰计，均在3000 以上；而缺丹参药材的阴性样品溶液色谱中在丹参酮Ⅱ_A相应的位置无色谱峰，说明阴性样品没有干扰。（见图1）

图1再生血片的含量测定HPLC色谱图（A：对照品B：样品C：阴性样品）

2.4 标准曲线的制备

精密吸取浓度为0.0921mg/mL的丹参酮Ⅱ_A对照品溶液2，4，6，8，10，12，14μL注入高效液相色谱仪测定，以对照品进样量（µg）为横坐标，色谱峰峰面积值为纵坐标，求得回归方程：y=11703.89x-2.93，r=0.9999（n=6）。结果表明丹参酮Ⅱ_A对照品在0.1824~1.2748µg范围内与峰面积呈良好的线性关系，结果见表1-1。

表1-1 丹参酮ⅡA标准曲线

进样量（µg）	0.1825	0.3649	0.5473	0.7297	0.9121	1.0945	1.2749
峰面积	2123.9	4266.2	6417.7	8546.1	10685.7	12724.7	14963.1

2.5 精密度试验

取对照品丹参酮ⅡA溶液，进样量10μL，进样5次，测定丹参酮Ⅱ_A峰面积，RSD为1.81﹪（n=6），符合要求，测定结果见表1-2。

表1-2 精密度试验

进样序次	1	2	3	4	5	RSD﹪
峰面积	3249.5	3321.1	3277.7	3270.9	3290.8	1.81

2.6 重复性试验

取同一批样品，分5次精密称取0.2g，同供试品溶液制备方法操作，置于10mL容量瓶中，进样量：10μL，测定每份样品中丹参酮Ⅱ_A的含量。样品中丹参酮Ⅱ_A平均含量为0.6490mg/片，RSD：0.91％（n=6），重现性良好，结果见表1-3。

表1-3 重复性试验

编号	称样量(g)	峰面积	含量（mg/片）	平均含量（mg/片）	RSD(％)
1	0.2027	218.6	0.6492	0.6490	0.91％
2	0.2010	224.0	0.6484
3	0.2035	215.3	0.6495
4	0.2015	216.0	0.6489
5	0.2021	223.0	0.6490

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液10μL，分别在0、2、4、6、8、10h，测定样品中丹参酮Ⅱ_A峰面积，测得峰面积值的RSD为1.28％（n=6），说明供试品溶液在10h内稳定，结果见表1-4。

表1-4 稳定性试验

时间（h）	0	2	4	6	8	10	平均值	RS（﹪）
含量（mg/片）	0.6492	0.6488	0.6485	0.6494	0.6486	0.6480	0.6488	1.28

2.8 回收率试验

采用加样回收法，取样品粉末，精密称定0.15g（共6份），分别精密加入丹参酮Ⅱ_A对照品溶液（0.0921mg/mL）17mL，同供试品溶液制法配制，制成回收率用供试品溶液，测定样品中含量，计算回收率，结果平均回收率为97.80％，RSD为1.54％（n=6），符合要求，结果见表1-5。

表1-5 回收率试验

编 号	称样量 （g）	样品中丹参酮ⅡA含量（mg）	对照品加 入量（mg）	测得量（mg）	回收率	平均回收率 （％）	RSD （%）
					（%）
1	0.1501	0.5024		2.0534	98.38
2	0.1503	0.5379		2.0889	95.89
3	0.1499	0.4997	1.5510	2.0507	98.71	97.80	1.54
4	0.1500	0.5015		2.0525	99.04
5	0.1500	0.5007		2.0517	98.69
6	0.1500	0.5004		2.0514	96.10

2.9 样品的含量测定

取不同批号样品3份，精密称取0.2g，同供试品溶液制法配制，进样量为10μL，测定每批样品中丹参酮Ⅱ_A的含量，结果见表1-6

表1-6 丹参中丹参酮ⅡA含量测定结果

样品批号	平均含量（mg/片）	RSD(％)
190601	0.6490	1.26
190602	0.6484	1.03
190603	0.6498	1.58

3. 结论

在血再生片中丹参药材，其主要有效成分为丹参酮ⅡA，通过参考文献^［3-5］，在对样品的处理过程中，对丹参提取方法主要有两种：加热回流提取法和超声提取法，按照上述两种提取方法制备的供试品溶液，进行2.1色谱条件测定，结果表明，加热回流提取的效率更高，且杂质性成分相对较少，丹参酮ⅡA 峰型也较好，所以选择加热回流作为提取方法。

通过以上实验测定血再生片中丹参酮ⅡA 的含量，结果表明此方法简便、准确、稳定性与重复性好，可有效用于该制剂的质量控制。

参考文献

[1]卫生部.药品标准中药成方制剂（第八册）[S].1992:69

2. 国家药典委员会.中国药典[S].北京:化学工业出版社,2015

3. 李绍林，张建军． 丹参提取工艺优选［J］．中国实验方剂学杂志2011，17( 12) : 45 － 47．

4. 甘方良，李丽．正交试验法优化丹参乙醇回流提取工艺［J］．中国医院药学杂志，2011，31( 8) : 646 － 649．

5. 张 迎，李 萌．丹参酮ⅡA 的提取与分离［J］．延安大学学报， 2010，8( 3) : 67 －68．