病毒照妖镜—实时荧光 RT-PCR专利分析

高世芝

摘要新冠肺炎爆发，战“疫”是全世界面临的重要任务，而快速确诊是疫情防控的基础。根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》以及《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南（第四版）》记载，利用实时荧光PCR进行核酸检验是主要诊断手段。作为当下新冠肺炎确诊的“金标准”，实时荧光PCR功不可没。但通过新闻报道，我们不难发现当前诊断依然存在确诊慢、假阴性等问题。何为实时荧光PCR？为何还不能完全快速准确地诊断新冠？如何改进？今天我们就从专利的视角，聚焦实时荧光PCR，为大家揭开其神秘面纱。

关键词： 新馆病毒 PCR 专利 假阴性 检测速度

一、何为实时荧光PCR

PCR（polymerase chain reaction，PCR）即聚合酶链式反应，是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。在人类的生命周期中，细胞中1条双链DNA分子可以在DNA聚合酶（即PCR中的“P”）的作用下复制成2条一模一样的双链DNA分子，即获得2个拷贝数。PCR技术就是在试管中模拟DNA在细胞中的复制过程，将微量的DNA分子进行多次循环的复制，使得最初极为微量的DNA分子获得大量的拷贝数，进而对获得的DNA分子进行比对和检测。

针对遗传物质是RNA的病毒，需要先将RNA提取出来，用酶把RNA序列逆转录（即RT）成DNA分子，然后对得到的这些DNA分子进行多次循环复制（即RT-PCR）。

实时荧光PCR是在原有技术的基础上，将荧光基团加入到PCR 反应体系中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值），病毒核酸浓度越高，Ct值越小。

RT-PCR技术原理图

赛默飞生命科学 Quantstudio 6 Flex 系列PCR仪

二、实时荧光PCR核酸检测的无奈

根据新闻报道，当前实时荧光PCR的不足集中体现在检测速度和准确度上。

“一盒难求”“高度疑似却无法确诊”“确诊用时长”“假阴性”“假阳性”“出院后复阳”，以及检测过程中医护人员被感染，无不对PCR技术提出更高要求。

核酸取样加样

三、从专利视角为PCR支招

1．提高检测速度

实时荧光PCR检测中，耗时最长的就是DNA扩增阶段（即热循环阶段），提高热循环的效率、减少DNA扩增时间是提高检测速度的方法之一。此外，实现高通量检测也是提高检测速度的重要方法。

①缩短扩增时间

专利US6780617B2利用Peltier元件单独设置处理位点来冷却各个热循环步骤之间的样品，以减少相继两个步骤间的降温时间，进而减少每次热循环所需的时间。

US6780617B2 附图

上述专利采用的是固体热源，由于固体比热的自身缺陷，升降时间存在瓶颈。对此， 专利JP3136129B2、US6472186B1更换热源种类，采用热容量小的“气体热源”，热源自身的温度升降很快，有效的将热循环扩增时间缩短到数十分钟，但稳定性不足。

随着MEMS技术、微流控芯片技术的发展，微流控技术被应用到PCR扩增中，其中US9651039B2等诸多专利中均采用连续流动型PCR微流控芯片，实现了热循环由时间向空间的转换，大大缩短了扩增时间。在此基础上，为了自由设置热循环过程中样品与各温度区的接触时间，专利JP4579490B2将彼此间隔的多个温度区通过微通道连接，使样品溶液往复流经相同微通道，在其中被加热。微流控技术有效地将DNA扩增时间缩短到5分钟之内。

②实现高通量检测

在一个热循环中同时实现多路核酸样本的检测，即高通量检测同样能够提高检测速度。

专利US6927045B2利用高通量毛细管阵列对电泳系统进行分析，核酸被可饱和而可逆地捕获在反应室，在毛细管内直接进行反应，实现高通量检测。专利US8467061B2通过设置光源切换方式实现不同激发光激发，实现多通道检测。专利申请CN108181239A利用转盘等结构设置多个LED光源，形成多个检测通道。专利JP6564441B2通过优化系统的内部结构和自动化检测流程，实现高通量检测。

US6927045B2附图

2．提高检测准确性，防止假阴性、假阳性

相较于检测速度，提高检测准确性更为关键，假阴性患者的出现，可能会感染更多人。

①防止假阴性

在实时荧光PCR检测中，假阴性一般是由于PCR扩增失败导致的，如提取过程中靶基因的丢失、提取试剂残留、标本中抑制物去除不彻底、扩增仪孔间温度差异等。现有技术中，避免假阴性最有效的措施是建立“内标”。

专利CN101717829B公开了“非竞争性内标”，在同一试管内用两对引物同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标序列。通过比较两种序列的扩增产量，可对靶序列定量。通过抗干扰实验判断PCR检测的稳定性，通过检测人工污染样品判断扩增内标是否指示假阴性。

专利CN102424852B公开了“竞争性内标”，构建一个扩增效率、引物结合位点与靶基因相同的、仅探针结合位点不同的内标，在同一反应管内，靶基因与内标物和引物竞争性结合，进行同步扩增。靶基因的量可通过与产生相同产物的竞争物的量相比较而得到。

②防止假阳性

假阳性一般是由于PCR扩增污染导致的，主要是样品提取或扩增过程中，相邻样品间的交叉污染造成的。避免假阳性的手段包括酶处理以及实验设备优化等。

通过添加酶，破坏PCR反应液中DNA的能力，DNA被降解，而DNA聚合酶活性不受影响。这种酶处理的方法大致相同，例如专利AU636499B2通过向扩增产物中引入至少一种修饰物从而降低或消除由污染的扩增产物产生的背景值，在将新测试试样中的靶序列扩增之前，对试样进行处理，选择性地除去该污染扩增产物，使之不能在新测试试样中扩增。

预防假阳性，关键在于防止污染，尤其是“样品—样品”间的污染，其主要存在形式是气溶胶污染和样品残留污染，例如离心管打开时，形成液体飞溅或气溶胶、移液操作不当等。针对上述情况，可以通过对实验设备进行优化，降低样品间的交叉污染，提高检测的准确性。

专利US9517472B2从改善样品在不同模块之间的分配方式出发，采用例如气泵、磁场、电场等方式实现试剂或样品在密封空间内的分配，极大地减少了气溶胶的产生，在减少样品间交叉污染的同时，也能够更好地保障检测人员的安全。

US9517472B2附图

微流控技术在PCR中的应用，能够实现检测仪器的集成化和全封闭设计，将病毒的提取、分离、扩增、检测都集成在芯片上。待取样完成后，操作人员仅需将添加好试样的微流控芯片放置在检测仪器中，密封好检测仪器，之后所有的操作均可自动化完成，极大地避免了气溶胶的产生，防止样品间的交叉污染。例如专利CN102286358B、专利申请US2019046989A1。

US2019046989A1附图

当然，上述专利中涉及的方法仅是在实时荧光PCR检测过程中采取的手段，在实际的病毒检测中，从采样、贮存、运输、到核酸提取、再到仪器检测，改进可能导致检测结果出现偏差的各个环节都有助于提高准确性。除了不断提高技术和实验能力，采用多种检测手段相结合、取长补短，也能够进一步提高检测的准确性。

除核酸检测外，抗原快速检测、抗体检测等都是病毒检测的手段。目前，针对新冠病毒的抗体诊断检测正在紧锣密鼓地研发中，例如利用胶体金检测试剂进行体外定性检测人血清、血浆、全血样本，测试其中的IgM/IgG抗体浓度值，操作简单，15分钟即可肉眼判读结果，其可作为核酸检测的补充或协同，通过联合检测提高筛查排查率。上述血清学检测方法已被正式采纳，作为新冠肺炎第七版诊疗方案的确诊标准。

结语

通过以上对专利技术的分析可以发现，针对实时荧光PCR的改进有很多，但专利技术到商业应用，还有诸多问题需要考虑。随着技术的不断发展，实时荧光PCR定会日臻完善，第三代数字PCR也在高速发展普及。我们可以满怀希望，在不久的将来定能实现核酸的快速准确安全检测。

参考文献

[1] 新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）http://www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2020-02/19/content_5480948.htm

[2] 新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南（第四版）https://www.sohu.com/a/371923042_139908

[3] 南文龙. PCR 假阳性的原因分析及控制措施.中国动物检疫.2015:56-58

[4] 国家知识产权局抗击新型冠状病毒肺炎专利信息分析课题组.抗击新型冠状病毒肺炎专利信息研报.2020年

[5]武汉新型冠状病毒肺炎确诊，到底难在哪.http://m.guoke.com/article/456008