一种高耐酒精型酵母菌的性能研究

孙庆文 陈军

摘要：以五粮液酒业的酒糟为样品，通过富集培养分离和三级筛选试验，最终获得了1株高耐酒精型酵母菌JZ1菌株，并对其生物学特性进行了研究。结果发现：菌株JZ1具有较高的耐葡萄糖和耐酒精能力，其最适生长pH值为5.0，最适培养温度为30℃，在此条件下其发酵能力最强，本研究将为下一步的应用工作提供依据。

乙醇作为一种环保型可再生能源，已经广泛应用于食品、燃料等多个行业。目前，国内外的酒精行业正在快速发展，如何能提高成熟醪的酒精浓度，不仅可以降低生产时的能耗，而且能提高设备利用率，因此,提高发酵醪酒精浓度受到国内外学者的高度重视^[1]。

酵母菌是酿酒工业主要微生物。在发酵过程中，酵母所产酒精含量达到一定浓度后则会对其自身产生毒害作用，Guiliennond等研究发现，酵母属的各种间或同一种的各菌株间，对自身产生酒精耐受力的大小能够决定其发酵能力^[2]。本研究采用自然选育的方法，从五粮液酒厂的酒糟中筛选出一株高耐酒精的酵母菌株，并对其生物学特性进行了研究，以期为下一步的应用工作提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品

酒糟：由五粮液酒业提供。

1.1.2试剂

发酵培养基：酵母浸膏10g，葡萄糖200g，硫酸铵1 g、大豆蛋白胨20g、水1000mL、115℃灭菌20min。

TTC上层培养基：琼脂1.5g、葡萄糖0.5g、TTC 0.05g、水100mL、115℃灭菌20min；

TTC下层培养基^[3]：YPD液体培养基：大豆蛋白胨10g、葡萄糖20g、酵母浸膏10g、水1000mL、115℃灭菌20min;

1.2实验方法

1.2.1酵母菌的富集及分离

取一定量酒糟至培养基中进行富集培养，之后再将菌液加至另一新鲜含酒精5%vol的培养基中，24h后稀释涂布，静置培养，分离纯化^[4]。

1.2.2耐高酒精酵母菌株的筛选^[5]

一级筛选：TTC产酒精试验。二级筛选：杜氏小管产气试验。三级筛选：试管发酵试验。

1.2.3 耐酒精酵母菌株的生物学特性研究^[6]

(1) 不同pH试验：将所得的高耐酒精酵母菌株分别接种于不同pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)的YPD液体培养基中进行实验。

(2)不同温度试验：将筛选所得高耐酒精酵母菌株分别接种于YPD液体培养基中，分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下进行实验。

(3)耐葡萄糖试验：将所得高耐酒精酵母菌株分别接种于不同浓度葡萄糖(10％、20％、30％、40％、50％)的YPD培养基上进行实验。

(4)耐乙醇试验：将菌株JZ1分别接种于酒精度为10％vol、12％vol、14％vol、16％vol、18％vol的YPD液体培养基中进行实验。

2结果与分析

2.1耐高酒精酵母的筛选

经过对样品的富集培养，共分离出24株酵母菌，经过TTC产酒精显色试验，共筛选出8株能力相对较强的菌株。再经过杜氏小管产气试验，筛选出了JZ1,JZ4,JZ5,JZ7共4株菌株，最后对这4种菌株进行酒精发酵试验，其结果如表1所示。

表1 菌株发酵性能情况

菌株编号	二氧化碳失重/g		残糖量/（mg/ml）		酒精度/%vol
	36h	72h
JZ1	6.83	15.53		10.31		9.05
JZ4	6.32	13.98		12.52		8.32
JZ5	5.02	13.28		14.96		7.96
JZ7	5.24	13.65		13.03		8.13

由表1可知，在发酵72h后，从CO₂的失重量、残糖量和酒精浓度值可知JZ1号菌株的发酵能力最强，糖的利用率和酒精的产量在这四种菌株中都是最好的，下一步将把JZ1号菌株作为实验菌株，对其进行生物学特性研究。

2.2 JZ1酵母菌株的生物学特性研究

2.2.1 不同pH值实验

将所得JZ1酵母菌株分别接种于不同pH值的YPD液体培养基中，培养48h后在波长600nm处测定吸光度值。其结果如图1所示。

图1 不同pH下JZ1菌株的生长情况

由图1可知，菌液的吸光度值随pH的增大呈先上升后下降的趋势.当pH值为5.0时，吸光度值达到最大，表明此时酵母菌JZ1生长状况最好。因此，菌株JZ1的最适生长pH值为5.0。

2.2.2不同温度实验

将接种有JZ1酵母菌株的液体培养基中置于不同温度的培养箱内，恒温培养48h后，在波长600nm处测定吸光度值。其结果如图2所示。

图2 不同温度下JZ1菌株的生长情况

由图2可知，随着培养温度的增加，菌株JZ1菌液的吸光度值呈现先增加后下降的趋势，当培养温度为30℃时，菌液的吸光度值达到最大。因此，菌株JZ1最适的生长温度为30℃。

2.2.3耐葡萄糖试验

将菌株JZ1接种于不同葡萄糖含量的YPD培养基上，取相同量置于杜氏小试管中，并于30℃条件下恒温培养48h，观察试管内产气情况，通过比较产气量确定JZ1酵母菌的耐葡萄糖性能，结果如表2所示。

表2 JZ1的耐葡萄糖能力

菌种	葡萄糖浓度/%
	10	20	30	40	50
JZ1	++++	++++	+++	++	+

注：“+”表杜氏小试管内气体量的多少。

由表2可知，菌株JZ1在葡萄糖含量为10％、20％的YPD液体培养基上长势均良好；当葡萄糖含量>30％时，菌株JZ1的产气量开始下降，当葡萄糖含量为50％时，菌株JZ1仍旧存活，由此可知，菌株JZ1具有较高的耐葡萄糖能力。

2.2.4 耐乙醇实验

制备不同乙醇浓度的YPD培养基于杜氏小试管内，取相同接种量的JZ1菌株接入发酵培养基，恒温30℃培养48h后观察杜氏小试管中的产气量，结果如表3所示。

表3 JZ1的耐乙醇能力

菌种	乙醇浓度/%vol
	10	12	14	16	18
JZ1	++++	++++	++++	++	+

注：“+”表杜氏小试管内气体量的多少。

由表3可知，菌株JZ1在乙醇浓度为10％-14％时，酵母菌生长良好，产气量很多，当乙醇浓度>14％时，菌株JZ1的长势开始下降，产气量开始减少，由此可知，菌株JZ1的耐乙醇能力较高。

3结论

本研究通过对样品的富集培养和三级筛选从五粮液酒糟中筛选出了一株高耐受酒精的酵母菌株JZ1，并对其生物学特性进行了研究。结果发现，菌株JZ1具有较高的耐葡萄糖和耐酒精能力，其最适生长pH值为5.0，最适培养温度为30℃，此条件下其发酵能力很强，在酿造等行业有着巨大的潜在应用价值。

参考文献：

[1]燃料乙醇产业前景[J]. 孙陆晶.  化学工业. 2011(01)

[2] Fukuda. Sake brewing characteristics and multidrug resistance of trichothecin-resistant yeast mutants[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology. 1999(05)

[3]高效酒精酵母菌选育及其特性研究[J]．罗跃中,李忠英,李继睿等. 中国酿造. 2013 (08)

[4]一株耐高浓度乙醇酒精酵母的筛选及发酵特性研究[J]. 吴华昌,肖辰,邓静,谭文其. 中国酿造. 2012(03)

[5]耐高酒精野生酵母菌株的筛选及其特征研究[J]. 杨小冲,陈忠军等. 中国酿造. 2017(08)

[6]浓香型白酒生产中耐酒精酵母菌的选育研究[J]. 赖颖,郭捷,郭静娜. 酿酒科技. 2015(01)