基因芯片在分枝杆菌菌种鉴定及结核耐药基因检测的诊断价值

曹星杰

【摘要】 目的：研究基因芯片检测应用在分枝杆菌菌种的鉴定以及结核耐药基因检测中的临床应用价值。 方法：选取2018年6月~2019年6月我院采集的158例痰涂片检测为阳性的肺结核患者作为研究资料，将采集的患者痰液标本进行基因芯片检测鉴定以及使用全自动分枝杆菌检测系统（BD BACTEC MGIT 960，以下简称“MGIT-960”）培养，并实施耐药性检测分析。对比不同方法的一致性。 结果：RFP检测中，124例患者样本内通过基因芯片法与培养法结果相同均为115例：以MGIT-960培养为参考，基因芯片法准确定为92.7%、灵敏度为79.3%、特异性为96.8%、Kappa为0.790；INH的检测中，124例患者样本内通过基因芯片法与培养法结果相同均为98例，基因芯片法准确定为88.3%、灵敏度为78.1%、特异性为92.4%、Kappa为0.712。组间比较差异有显著性（P> 0.05）。 结论：利用基因芯片检测能够精准地鉴定出菌种类型以及耐药基因检测，且与MGIT-960培养具有较好的一致性，具有重要的临床推广价值。

【关键词】 基因芯片；分枝杆菌；菌种鉴定；耐药基因；肺结核

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2018年6月~2019年6月我院采集的158例痰涂片检测为阳性的肺结核患者作为研究资料，其中男性患者99例、女性患者59例，患者年龄为16~70岁，平均年龄（46.58±11.24）岁。研究中患者均符合《肺结核诊断》(WS288-2017)中肺结核临床诊断标准，并排除其他重大疾病；经过病理检测后确诊为肺结核。

1.2 仪器及试剂

基因芯片检测平台及分枝杆菌配套试剂生产厂家为北京博奥生物有限公司，其中包含DNA提取液、聚合酶链式反应扩增试剂、RNA杂交缓冲液等；MGIT-960培养设备以及试剂生产厂家为美国碧迪公司

1.3 方法

使用基因芯片检测16种分枝杆菌，结核耐药基因检测为利福平（RFP）耐药性基因rpo上的6个点位（见表1）以及异烟肼（INH）耐药性基因KatG与inhA启动子的各1个位点（见表2）。

表1 基因芯片检测点位

基因芯片检测范围
类别		分枝杆菌
I群（光产色菌）		堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌
Ⅱ群（暗产色菌）		戈登分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、苏加分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌
Ⅲ群（不产色菌）		鸟分枝杆菌复合群、胞内分枝杆菌、土分枝杆菌、不产色分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌
IV群（快速生长菌）		偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌

表2 结核耐药基因检测点位

RFP耐药性基因rpo点位	INH耐药性基因KatG与inhA启动子位点
531位：TCG→TTG、TCG→TGG；526位：CAC→GAC、CAC→TAC、CAC→CTC、CAC→CGC；511位：CTG→CCG；513位：CAA→CCA、CAA→AAA；516位：GAC→GTC；、GAC→TAC、GAC→GGC；533位：CTG→CCG	katG 315位:AGC→ACC、AGC→AAC；inhA 启动子-15位C→T突变型

（1）标本处理

在痰液标本中加入两倍样本体积的n-乙酰-l-半胱氨酸（0.5%）及NaOH溶液，振荡处理10~15min，之后室温下静置30~45min，使用1.5ml离心管吸取1ml溶液标本进行基因芯片检测，其余溶液标本进行结核耐药基因检测。

（2）核酸处理

使用1.5ml离心管吸取1ml溶液标本，振荡处理5~10min，弃掉上清液并加入80μl DNA提取，充分振荡后转入核酸提取管，使用核酸快速提取仪处理5min后将其置于水浴（95℃）5min，之后取出离心处理2min；将聚合酶链式反应扩增试剂解冻摇匀后按照标准程序实施扩增；将聚合酶链式反应产物变性处理（95℃）5 min、RNA杂交缓冲液热浴处理（50℃）10min后骤冷冰浴处理3min，之后按照3:2比例进行混合；装配杂交盒后吸取混合液滴置在芯片点阵，进行密封预热（50℃）；按照分枝杆菌菌种鉴定芯片杂交程序（50℃下）处理2h；实施洗涤和干燥处理。

（3）结果判读

使用分枝杆菌菌种鉴定基因芯片检测系统对鉴定芯片进行判读，记录信息数据；使用结核杆菌耐药性基因芯片检测系统对核酸提取、扩增结果进行判读。

1.4 评价标准

将Kappa检验值作为不同方法的一致性程度判断指标，Kappa检验取值范围为0~1.0，其中数值大于等于0.75说明不同的方法具有较好的一致性，数值大于等于0.4、小于0.75说明不同的方法具有一般的一致性，数值小于0.4则说明不同的方法具有较差的一致性。

1.5 统计学处理

使用SPSS 24.0进行统计学分析处理，计数资料以率（%）表示，行χ²检验，处理结果P<0.05表示差异显著，具有统计学意义

2 结果

2.1 检测情况分析

基因芯片检测中，有10例患者样本未检测出MTB（6.33%）、3例患者样本结果判别无效（1.90%）、11例患者样本检测结果为NTM（6.96%），可用于分析基因芯片结果共134例。根据培养样本结果显示，有14例患者样本呈现为阴性（8.86%）、9例患者样本发生污染（5.70%），分枝杆菌培养阳性样本MTB/NTM分群共有135例，其中呈现NTM结果的为11例（8.15%），可进行药敏分析患者样本共124例。经过综合上述结果，最终确定124例检测结果进行耐药基因检测。

2.2 菌种鉴定检测结果分析

基因芯片检验中11例患者样本检测结果为NTM，以培养样本检测NTM结果为例，检出率为100%，其中菌种检测出7种，分别为：胞内分枝杆菌3例、龟分枝杆菌2例、脓肿分枝杆菌2例、鸟分枝杆菌1例、不产色分枝杆菌1例、偶然分枝杆菌1例、堪萨斯分枝杆菌1例。

2.3 药物敏感性试验结果分析

基因芯片亦可进行MTB对RFP、INH的耐药性试验，其中RFP检测中，124例患者样本内通过基因芯片法与培养法结果相同均为115例：以MGIT-960培养为参考，基因芯片法准确定为92.7%、灵敏度为79.3%、特异性为96.8%、Kappa为0.790；INH的检测中，124例患者样本内通过基因芯片法与培养法结果相同均为98例，基因芯片法准确定为88.3%、灵敏度为78.1%、特异性为92.4%、Kappa为0.712。组间比较差异有显著性（P> 0.05），见表3。

表3 基因芯片法和培养法检测RFP及INH的药物敏感性分析

	基因 芯片	MGIT-960培养		准确度（%）	灵敏度（%）	特异度（%）	Kappa	P
		耐药性（n）	敏感性（n）
RFP	耐药性（n）	23	3	92.7%	79.3%	96.8	0.790	＞0.05
	敏感性（n）	6	92
INH	耐药性（n）	25	6	88.3	78.1	92.4	0.712	＞0.05
	敏感性（n）	7	73

3 讨论

目前我国NTM感染人数呈每年上升的趋势，NTM与MTB同为抗酸杆菌，具有较高的相似性，易在临床中发生误诊的情况，并且NTM对常规治疗药物具有一定的耐受性，因此有效的NTM检测方式对于临床诊断治疗具有重要的作用及意义^[1,2]。在结核病检测中广泛采用抗酸杆菌涂片检查、固液培养基以及药敏试验等方式，这些检测方法在实际应用中均存在一定的局限性，因此亟需一种新型的技术突破现有的瓶颈^[3]。随着现代分子诊断技术的不断创新，基因芯片技术已经能够较好地应用在医学检测中，并且具有检测快、结果准确性高等优势，在NTM的诊断治疗中具有重要的应用价值^[4]。

对于结核病的治疗，专家学者普遍认为其关键是对分枝杆菌的耐药性检测，在准确的检测结果下可以有效地控制疾病的传播

^[5]。在本次研究中，RFP检测124例患者样本内通过基因芯片法与培养法结果相同均为115例：以MGIT-960培养为参考，基因芯片法准确定为92.7%、灵敏度为79.3%、特异性为96.8%、Kappa为0.790；INH的检测124例患者样本内通过基因芯片法与培养法结果相同均为98例，基因芯片法准确定为88.3%、灵敏度为78.1%、特异性为92.4%、Kappa为0.712。组间比较差异有显著性（P> 0.05）。研究结果与陈国会等人相一致^[6]。说明MTB耐药性检测基因芯片法和培养法的检测结果关联性显著，能够准确地检测出菌种的耐药性。

综上所述，利用基因芯片检测能够精准地鉴定出菌种类型以及耐药基因检测，且与MGIT-960培养具有较好的一致性，具有重要的临床推广价值。

参考文献：

[1] 常凤霞. 基因芯片快速分枝杆菌鉴定技术与涂片抗酸染色技术的临床应用效果比较[J]. 医疗装备, 2017, 30(02): 1-2.

[2] 税雪姣，黄富礼，黄永茂. 结核分枝杆菌耐药基因快速检测研究进展[J]. 西南军医, 2016, 18(06): 565-568.

[3] 舒丽红，丁显平. 基因芯片方法检测耐异烟肼结核分枝杆菌准确性的Meta分析[J]. 检验医学与临床, 2016, 13(15): 2121-2125.

[4] 汪领，胡正义，郭琪. 基因芯片技术检测对结核分枝杆菌耐药的诊断价值[J]. 中华实用诊断与治疗杂志, 2018, 32(04): 393-394.

[5] 林秀华，赖国祥，陈雨燕，等. 基因芯片技术检测分枝杆菌和异烟肼、利福平耐药性在结核性脓胸诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病学报, 2017, 33(08): 720-723.

[6] 陈国会，冯大山，王秀丽，等. 应用基因芯片检测系统诊断结核分枝杆菌感染及耐药基因突变的临床研究[J]. 国际检验医学杂志, 2017, 38(05): 638-640.