耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因与毒力基因检测研究

李继专

【摘要】 目的：探究耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因及毒力基因检测状况。 方法：本研究中所使用的200株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离自我院2018年6月-2019年5月住院患者送检样本，主要为患者气管分泌物、脓液、患处血液、穿刺液、排泄物等。菌株抗菌药物敏感性试验依据2019年CLSI标准执行，所采用的方法为纸片扩散法; 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的毒力基因、耐药基因检测采用PCR法。 结果：本次研究在样本中共分离出200株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，其中气管分泌物中样本构成占比61.5%、脓液中样本构成占比12.5%、患处血液中样本构成占比12.0%、其它分泌物中样本构成占比6.5%、患者穿刺液中样本构成占比4.0%、排泄物中样本构成比为3.5%；200株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对苯唑西林、头孢曲松、庆大霉素、亚胺培南、四环素以及环丙沙星耐药率分别为100.0%、85.71%、73.68%、62.41%、51.13%、42.86%，而对于万古霉素耐药率则为0%；fnbA、Pvl、clfA、tst、sec、sasX的阳性率分别为60.0%、88.5%、42.0%、7.5%、4.5%、0.0%；依据DNA标志物（DL-2000）：fnbA基因为642bp、pvl基因为939bp、clfA基因为292bp、tst基因为594bp、sec基为325bp。 结论：本研究中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对苯唑西林具有完全耐药性，分析原因可能是菌株的生物膜形成及毒力的下降具有一定的联系；菌株的毒力因子呈现不同的分布状态可能是由于其分离标本、遗传因素具有一定的差异。

关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；毒力基因；耐药基因；基因分型

1 材料与方法

1.1 菌株

本研究中所使用的200株MRSA分离自我院2018年6月-2019年5月住院患者送检样本，主要为患者气管分泌物、脓液、患处血液、其它分泌物、穿刺液、排泄物等。对样本进行MRSA分离并剔除其中重复菌株。

1.2 菌种鉴定试剂及仪器设备

本次研究所使用的菌种鉴定试剂及仪器设备如表1所示。

表1 菌种鉴定试剂及仪器设备

设备/产品名称	型号	品牌
全自动微生物鉴定系统	VITEK 2 COMPACT	法国梅里埃
紫外可见分光光度计	Alpha-1860S	上海谱元仪器
PCR仪和实时荧光定量PCR仪器	Applied Biosystems	美国赛默飞
台式微量离心机	Microfuge 20/20R	美国贝克曼库尔特
E-Ge Imager凝胶成像仪	Invitrogen	美国赛默飞
DNA 聚合酶	Platinum SuperFi	美国赛默飞
核酸纯化试剂盒	Agencourt AMPure XP	美国赛默飞
等分子生物学试剂	dl15000	美国赛默飞
蛋白酶K/Proteinase K		美国SIGMA
PCR纯化试剂盒		美国SIGMA
dNTPs	2.5 mM each	上海菜枫

1.3 方法

（1）药敏试验

本研究中菌株抗菌药物敏感性试验依据2019年CLSI标准执行，所采用的方法为纸片扩散法；在进行试验过程中记录MRSA的敏感、中介及耐药情况^[1]。

（2）基因检测

MRSA的毒力基因、耐药基因检测采用PCR法，引物序列设计见文献^[2]，采用规范步骤实施检测。PCR引物序列及产物长度如表1所示。

表1 PCR引物序列及产物长度

靶基因	引物序列（5' to 3'）	产物长度（bp）
fnbA	P1:GATACAAACCCAGGTGGTGG P2:TGTGCTTGACCATGCTCTTC	642
pvl	P1:GCAGCTCAACATATCACACC P2:TGTTTCCAGCAGCTTTGAG	939
clfA	P1:AТТGGСGТGGСТТСAGТGСТ P2.CGTTTCTTCOGTAGTTGCATTTG	292
tst	P1:TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT P2:TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT	594
sec	P1:CCAACCAGACCCTAC P2: ACAAGTTTTGCCACC	325
sasX	P1:AGAATTAGAAGTACGTCTAAATGC P2.GCTGATTATGTAAATGACTCAAATG	615

2 结果

2.1 菌株分离情况

本次研究在样本中共分离出200株MRSA，样本中样本株树、构成占比、样本数量以及分离情况如表3所示。

表3 MRSA标本来源及构成数据

标本出处	株数	构成占比	标本数量	分离率
气管分泌物	123	61.5%	305	40.3
脓液	25	12.5%	175	14.3
患处血液	24	12.0%	156	15.4
其它分泌物	13	6.5%	141	9.2
患者穿刺液	8	4.0%	105	7.6
排泄物	7	3.5%	179	3.9

2.2 药敏结果

200株MRSA对苯唑西林、头孢曲松、庆大霉素、亚胺培南、四环素以及环丙沙星耐药率分别为100.0%、85.71%、73.68%、62.41%、51.13%、42.86%，而对于万古霉素耐药率则为0%。MRSA耐药性如表4所示。

表4 MRSA耐药性

抗菌药物	敏感		中介		耐药
	株数	敏感度	株数	中介率	株数	耐药率
苯唑西林	0	0.0%	0	0.0%	200	100.0%
头孢曲松	9	4.5%	19	9.5%	171	85.5%
庆大霉素	23	11.5%	30	15.0%	147	73.5%
亚胺培南	50	25.0%	26	13.0%	125	62.5%
四环素	91	45.5%	8	4.0%	102	51.0%
环丙沙星	79	39.5%	35	17.5%	86	43.0%
万古霉素	200	100.0%	0	0.0%	0	0.0%

2.3 基因检测结果

200株MRSA毒力基因与耐药基因检测结果显示，Pvl、fnbA、clfA、tst、sec、sasX的阳性率分别为60.0%、88.5%、42.0%、7.5%、4.5%、0.0%；依据DNA标志物（DL-2000）：fnbA基因为642bp、pvl基因为939bp、clfA基因为292bp、tst基因为594bp、sec基因为325bp。MRSA毒力基因检测结果如表5所示

表5 MRSA毒力基因检测结果

基因	阳性株数	阳性率
fnbA	120	60.0%
pvl	177	88.5%
clfA	84	42.0%
tst	15	7.5%
sec	9	4.5%
sasX	0	0.0

3 讨论

目前MRSA成为了医院感染中极为常见的病原菌之一，尤其是患者在接受侵入性治疗或长期使用广谱抗生素后，受到感染后往往会出现严重的基础性疾病，并伴有免疫力低下等症状^[3]。本研究中的菌株样本主要采集自患者呼吸道分泌物（占比为（61.5%），可见MRSA多发于呼吸道感染，与相关资料具有一致性^[4]。

通过对MRSA进行更加详细耐药性的分析发现，其对苯唑西林、头孢曲松、庆大霉素、亚胺培南、四环素以及环丙沙星具有不同程度的耐药性，尤其是对苯唑西林具有完全耐药性，而对万古霉素耐药性则为0。分析原因可能是菌株的生物膜形成及毒力的下降具有一定的联系。根据研究可知，MRSA多出现于患者的呼吸道，其毒力因子主要为肠毒素、杀白细胞毒素、溶血素、毒性休克综合征毒素等，并具有不同的生物学特征以及致病特征。可见，MRSA之间的毒力差异不仅仅表现在菌株方面，也与细菌进化以及宿主之间具有一定的关联^[5]。在国内外的相关报道中，最为常见的为MRSA的毒力基因，而fnbA基因和clfA基因相关研究资料则较少，其中fnbA基因通过与蛋白的结合可进一步的增强MRSA的黏附能力^[6]。在相关的研究中，通过社区获得的MRSA菌体fnbA基因检出率显著高于医院获取的菌体，而本次研究中fnbA毒力检测的阳性率为60.0%，分析原因可能是由于其与pvl毒力基因发生了相互叠加。在MRSA菌株中clfA基因可通过结合蛋白A产生聚集毒素，并与MRSA在宿主细胞中的定值情况具有一定的关系。在本次研究中，clfA基因阳性检出率为42.0%，说明其在菌株中能够产生一定的致病能力。根据以上分析我们可以认为，附着毒力基因可以被视为细菌生存方面的毒力基因。

MRSA中pvl毒力基因在进行高度表达时会发生单核细胞发生被动被杀，死亡的细胞则会释放出炎性介质从而导致宿主组织细胞发生损伤；pvl毒力基因在进行低度表达时则会导致单核细胞凋亡。而MRSA中pvl毒力基因对白细胞产生杀伤后将导致患者出现炎症。当MRSA携带pvl基因将保持较高的耐药性，并通过重新编码毒力基因时其具有较强的致病性。在研究中发现，MRSA可以通过吞噬菌体溶源而获得pvl毒力基因，并以质粒途径的方式保持其能够在不同菌株之间进行传递^[7]。本次试验中pvl基因的阳性检测率为88.5%，说明其在医院环境中生存、传播能力较强，具有较大的危害性，因此，本次研究对临床中菌体的检测筛查具有重要的意义。

在本次研究中MRSA中检测到了sec，tst及sasX基因，可见MRSA能够携带sec基因和tst-1基因，并在感染者体内释放炎性因子导致患者产生疾病。MRSA中sasX基因表达细胞壁锚定蛋白，在不断的演变过程中将促使菌株聚集，导致菌体具有更强的黏附、定植能力。

综上所述，MRSA因其携带的毒力基因，成为了医院抗感染治疗中的重要问题，因此，通过及时有效的MRSA检测可为相关的临床治疗提供一定的数据支持。

参考文献:

[1] 朱吉超. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药性分析与毒力基因检测的研究[D]. 宁夏医科大学临床检验诊断学, 2017.

[2] 王莹. 金黄色葡萄球菌毒力基因检测及分子分型研究[J]. 中国实用医药, 2016(1):168.DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.01.126.

[3] 李爱青. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性监测及毒力基因tst生物学功能研究[D]. 苏州大学临床检验诊断学, 2017.

[4] 王伟，等. 2017年中国部分省市即食食品来源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性、毒力基因分布及分子分型[J]. 卫生研究, 2020,49(1):56-62.DOI:10.19813/j.cnki.weishengyanjiu.2020.01.010.

[5] 冯宁，等. 血流感染金黄色葡萄球菌分子特征及毒力基因分析[J]. 中华医院感染学杂志, 2019,0(2):161-165.

[6] 袁梦，等. 2009-2015年深圳市不同来源样本中金黄色葡萄球菌毒力耐药特征及分子分型研究[J]. 实用预防医学, 2019,26(4):420-426.DOI:10.3969/j.issn.1006-3110.2019.04.010.

[7] 曾云祥，等. 携带杀白细胞素基因金黄色葡萄球菌临床感染菌株的回顾性研究[J]. 中华医院感染学杂志, 2017,27(2):276-279, 291.DOI:10.11816/cn.ni.2017-162895.