反相液相色谱应用多肽分离纯化与制备的研究进展

郑岳平 黄振福 冯春华

摘要：反相液相色谱这种色谱分离模式，以疏水作用为检测基础，重复性高，因高分辨率及回收率在多肽分离纯化及制备中得到了广泛应用。本文主要就反相液相色谱分离原理及其在多肽分离纯化、肽图分析等领域中的应用进行综述。

关键词：反相液相色谱；多肽；分离纯化、制备

随生物技术发展，多肽类药物因抗菌、抗氧化、抗癌、抗高血压等特性在生物制药还有功能性食品等领域得到了广泛性应用。但多肽在固相合成下因体系复杂、副反应多，多肽纯度较低。反相液相色谱利用物质疏水特性差异及高分辨率在多肽及蛋白质等物质分离纯化中得到了广泛应用。

1 反相液相色谱分离原理

反相液相色谱固定相色谱主要为离子交换、氧化铝、硅胶等极性介质，固定相极性大于流动相。固定相载体具有疏水性，被分离物质按疏水性不同在反相液相色谱中发生作用，使得不同疏水性质分子在反相柱中被先后分离。疏水性弱的流出较快，疏水性强的则流出较慢。同其他色谱法对比，反相液相色谱操作简单、重复性好，具有分辨率高及回收率高的优势。分离纯化中国无需脱盐，操作步骤被大大简化，且蛋白质分析在色谱柱内会发生去折叠，内部疏水残基同固定相发生作用，提供更多信息，这一特性使反相液相色谱成为了多肽及蛋白质的一个主要分离模式。

2 反相液相色谱在多肽分离纯化与制备中的应用

多肽是蛋白质内有20种氨基酸按照不同排列方式以肽键连接而形成的一类化合物的总称。因组成肽的氨基酸种类多，且残基数量、种类不同，因此肽具有多样性这一特性。肽有双缩脲显色反应，强碱条件时与Cu²⁺反应会形成紫色的络合物。利用这一特性可对肽含量进行测定。当前肽类制品比较多见，不仅见于食品、药品，还有学者研究可用其进行艾滋病毒、SARS病毒等多种病毒的预防及阻止。越来越多研究者力求通过分离、纯化等方法获得更多多肽类的活性物质。多肽制备是利用生物化学的手段将蛋白质水解，将氨基酸合成，利用基因表达形式合成多肽类的化合物，最主要的制备方法就是酶解法、化学合成法及基因工程法。

反相液相色谱主要应用的领域就是多肽制备分析。分子结构简单的多肽在不影响产物活性下，反相液相色谱是对其纯化制备的重要手段。且反相液相色谱重复性高，拥有较高分辨率，使得其在多肽分析领域中一直占据着核心地位。尽管反相液相色谱中因有机溶剂存在还有固定相的疏水性会对多肽结构有一定影响，但并不影响其对多肽的鉴定。

2.1 多肽分离纯化

反相液相色谱对多数多肽纯化都比较适用。反相液相色谱中的流动相主要是水，同肽类生物学性质是相适应的，尽管流动相中存在的有机溶剂可能对肽天然构象产生影响，但当这些因素被除去之后，肽的构象还是可以恢复原状的，回收率可达到80%以上。学者早在1986年就曾用反相液相色谱法对神经肽进行分离纯化。

近些年众多学者利用反相液相色谱对多肽进行分离纯化，取得了很大成效。徐萍等对RPHC同超滤、凝胶过滤层析等不同分离纯化技术在虫蛹活性多肽制备中的特征进行了分析。谢博等对生物性肽的制备、分离纯化鉴定以及构效关系进行了研究，并对反相高效液相色谱法对生物性肽分离纯化的机理进行了分析^[1]。李健民等基于尺寸排阻色谱(SEC)与反相液相色谱(RPLC)结合的新方法对大鼠肾脏翻译后的复杂体系蛋白质的分离和鉴定,特别是对于微量蛋白质的分析.首先使用SEC对蛋白质进行分离和富集,并酶解成多肽,再通过RPLC-MS联用的方法对酶解后的多肽进行分离和鉴定^[2]。曹福祥等用反相高效液相色谱法, 以0.02 mol/L醋酸铵-乙腈为流动相的梯度洗脱模式, 从灰花纹鹅膏菌中分离纯化出α-鹅膏毒肽，产量可达到每克蘑菇干子实体 6556 μg.产品纯度达99%以上，回收率为96%^[3]。SUN Hao等用反相高效液相色谱法对鸡胚多肽进行了分离纯化^[4]。还有学者用反相高效液相色谱法对抗菌肽、血管紧张素I转换酶抑制肽、钙结合蛋白D9K、蝎毒素多肽等进行了分离纯化，并有很多学者给出了多肽分离纯化的条件。如刘畅等给出了东北林蛙皮肤活性肽的反相高效液相色谱纯化的体系条件为：测波长216nm和280nm;流动相为乙腈:甲醇:水/TFA=9%:1%:90%;流速0.5ml/min;进样量20ul.rn^[5]。

2.2 肽图分析

肽图分析是按多肽分子量大小，用专一性强的蛋白水解酶对多肽进行检测鉴定，让其作用于特殊肽链点，并利用分离检测方法所形成的特征性的指纹图谱。肽图分析在多肽结构鉴定及特性分析上有重要作用。如通过胰蛋白酶能对Arg及Lys羧基端肽链发生特异性作用这一性质，通过反相高效液相色谱的C18柱能对重组生长素肽片段进行检测，并获得生长激素（rhGH）胰肽的特征性图谱。人类肿瘤坏死因子因具有单克隆的抗体性结构，因此也能通过反相高效液相色谱法确定肽图，通过肽图可方便对其进行鉴定分析。

随质谱技术不断发展，反相高效液相色谱技术同反相肽图有效结合已经成为一种更为快捷的多肽蛋白序列测定方法。且反相高效液相色谱还能通过多肽内细微结构上的差异性分析，对多肽进行修饰性分析，对多肽构象进行恢复检测等。

3 展望

随生命科学不断发展，生物制品分离纯化技术推动了多肽类药品及保健食品的发展。对多肽生物活性物质的分离活化技术不断向纵深发展，取得了很多可喜成果。反相液相色谱法因其独特优势在多肽分离纯化中获得了人们认可，加之RPLC生物传感器、RPLC质谱等的出现使反相液相色谱法多肽在线分析成为了可能，能对多肽物质进行纯度、活性的实时分析，并实现了流程上的自动化，为临床病理、医药等领域深入研究提供了可靠有段，推动了生物化学的纵深发展。

参考文献

1. 徐萍, 陈瑶, 李倩,等. 虫蛹活性多肽的制备、分离和生物活性研究进展[J]. 生物技术进展, 2018, 8(05):21-26.

2. 谢博,傅红,杨方.生物活性肽的制备、分离纯化鉴定以及构效关系研究进展[J]. 食品工业科技, 2021, 43(05):382-391.