新冠病毒核酸检测假阳性原因分析及对策

梁玉振

【摘要】目的：分析应用RT-PCR法检测新冠病毒核酸出现假阳性结果的原因，并提出解决对策。方法：选择2020年6月15日至2021年6月30日40000例疑似新冠肺炎或新冠肺炎密切接触者的咽拭子样本进行研究，均应用RT-PCR法进行新冠病毒核酸检测，应用成都迈克生物试剂盒首检，对于首检阳性或疑阳性的样本用长沙圣湘生物试剂盒复检，总结假阳性样本数量及其原因。结果：40000例样本中初检阳性17例，复检阳性0例，阴性17例，即假阳性17例。假阳性样本中3例因结果判断失误所致，7例非特异性扩增因素所致，7例核酸污染因素所致的。结论：核酸污染、非特异性扩增、结果判断失误是新冠病毒核酸检测假阳性发生的主要原因，故需进一步完善PCR实验室质量控制，提高检验工作人员的规范操作，准确判断结果，以降低核酸检测假阳性率，为疫情防控提供更为可靠的诊断结果。

【关键词】新冠病毒核酸检测；假阳性；原因

新冠肺炎是由感染新冠病毒而引起的急性传染性疾病，目前临床对本病治疗尚缺乏有效根治方法，其治疗策略主要是及早发现疑似病例，集中治疗确诊病例，提高病例早诊早治率，改善患者的临床结局。在诊断方面，新冠肺炎的确诊需具有病原学证据——新型冠状病毒（2019-nCov）核酸检测阳性，或病毒基因测序与抑制的2019-nCov高度同源^[1]。而应用实时荧光定量PCR法检测核酸应具有较高灵敏度和较强特异性，且其可批量化、检测费用较低，成为当前临床确诊新冠肺炎的主要手段。但是在实际工作中，我们发现部分初次检测核酸阳性的病例，复核为阴性，导致应用新冠病毒核酸检测阳性作为确诊标准备受质疑。为此，本研究根据自身工作经验以及咨询专家，从核酸提取过程、试剂盒、结果判断等多方面对核酸检测的相关影响因素进行探讨分析，总结新冠病毒核酸检测假阳性的原因，进而为提高核酸检测准确性提供依据。

1资料和方法

1.1一般资料

选择2020年6月15日至2021年6月30日40000例疑似新冠肺炎或新冠肺炎密切接触者的咽拭子样本进行研究。

1.2方法

所有样本均应用RT-PCR法进行新冠病毒核酸检测，具体方法：

1.2.1样本采集与运输：均经培训和考核合格的医务人员对受检者进行鼻咽拭子采集，样本置于专用样本保存管中，按照A类传染病运输包装分类运送至核酸检测实验室进行检测。

1.2.2检测试剂和仪器： PCR扩增仪（型号：LightCycler 480II ROCHE）；核酸提取仪（型号：美德瑞）；核酸提取或纯化试剂盒（迈克，圣湘）；扩增试剂均为我国药品监督管理局审批的2种国产新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，分别产自成都迈克和长沙圣湘生物；阳性质控品：2019-nCOV-RNA液体室内质控品（成都迈克和长沙圣湘）。

1.2.3检测方法：（1）核酸RNA提取：根据核酸提取或纯化试剂盒说明书进行操作，结合美德瑞核酸提取仪操作规程操作。（2）实时荧光RT-PCR检测：首次核酸检测应用成都迈克新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒说明书，对ORF-1ab基因、N、E基因进行PCR扩增操作.

1、阴性质控品：HEX或VIC通道CT值<=38，ROX通道>37或无CT值，其余通道>38或无CT值。

2、阳性质控品：扩增曲线呈S型，HEX或VIC通道CT值<=38，其余CT值<=32.

检验结果的解释

1、靶基因检测CT值判读：

CT值判读	阴性	阳性
FAM通道ORFlab基因	>38或无CT值	<=38
ROX通道E基因	>38或无CT值	<=37
CY5通道N基因	>38或无CT值	<=38
HEX或VIC通道内标	>38或无CT值	<=38

当HEX或VIC通道检测结果为阳性时，检测结果有效;或者HEX或VIC通道检测结果为阴性，但FAM通道、ROX通道和CY5通道中至少有一个检测结果为阳性时，检测结果有效。

2、样本结果判读：根据上述检测结果，判读如下：

试验结果	结果判断
ORFlab、N、E基因均+	2019-ncov阳性
ORFlab、N基因+	2019-ncov阳性
ORFlab、E基因均+	2019-ncov阳性
ORFlab基因+	重复测定，若仍为+，则判为阳性
ORFlab基因-	重复测定，若ORFlab基因+且E基因和或N基因+，则判为2019-ncov阳性；其他情况均判为可疑，需隔期复查。
ORFlab-且N基因+	同上
ORFlab-且E基因均+	同上
ORFlab、N、E基因均-	2019-ncov阴性

2结果

40000例样本中初检阳性17例，复检阳性0例，阴性17例，即假阳性17例。假阳性样本经复核发现3例因结果判断失误所致，7例非特异性扩增因素所致，7例核酸污染因素所致的。

3讨论分析

3.1结果判断失误致假阳性

相关研究报道^[2]，核酸检测结果失误主要是由于基线设置不当。基线值的作用是去除扩增起始阶段的背景荧光信号对检测结果的影响，大多数扩增仪的软件都会根据其仪器本身特性自动设置基线值的范围，但如果背景荧光信号过强，扩增仪软件可能会自动将其识别为扩增信号，致使基线值设置范围缩小，此时可见曲线起点较早，呈不规则或曲折样上升型，而不是光滑的S型曲线^[3]。本研究中3份假阳性样本经对比其扩增曲线与阳性曲线发现有显著的差异，我们手动调整扩增仪基线值范围后，样本复检显示为阴性。

3.2非特异性扩增因素致假阳性

本研究有7份假阳性样本在核酸初检中仅从Ct值方面来看该样本可判断为阳性，但是阴阳性对照组结果无异常，使其阳性结果存疑。为进一步验证结果的准确性，对试剂配制过程、核酸提取过程、扩增仪出现故障等可能原因均逐一排除，并咨询专家后怀疑是非特异性扩增所导致的。非特异性扩增主要是由于PCR检测中的引物设计无显著的特异性，致使引物与引物之间相互结合扩增，或是由于上下游的引物自身形成了“发卡样”结构，进而出现非特异性荧光信号，故表现为假阳性^[4]。此类因素所致的假阳性结果，其曲线特征多为S型扩增曲线起步较迟，而且在最后几个循环中扩增，荧光信号变弱，Ct值增加。当怀疑非特异性扩增致假阳性时，需更换不同厂家试剂盒重新检测。

3.3核酸污染因素致假阳性

本研究7份假阳性样本的曲线见有尾部抬高现象，但其扩增产物电泳条带亮度均一，这是PCR扩增系统受到污染的典型表现，需要仔细检查，逐一排除污染源。

（1）提取前污染——PCR试剂污染：可能是试剂盒在出厂、运输、贮存过程中受污染。在检测过程中根据试剂盒说明书将试剂分装好，直接加样到PCR仪器中扩增（加适量蒸馏水，不加阴性对照品），即可判断是否是试剂污染导致的假阳性。遇到此情况，更换试剂盒复检。

（2）提取环节污染——样本间、对照品交叉污染、气溶胶污染：在应用离心机进行离心处理、空气与液体面摩擦时、在操作时剧烈的摇动反应管，与此同时在进行开盖、吸样、闭盖时以及反复吹样时均有可能会形成气溶胶污染样本间。此外，上机检测前病毒模板加样顺序混淆也有可能引起对照品交叉污染而出现假阳性^[5]。针对上述情况，需将核酸检测转移到新的环境或转移到超净工作台中，且加样时严格按照阴性对照品、样本、阳性对照品的顺序，重新检测。

（3）上机扩增期间污染——扩增产物污染： PCR检测过程中可以在几个小时内将模板中部分特异性序列扩增到数百万倍以上，换句话说，PCR产物的拷贝量较大，显著高于PCR检测数个拷贝的极限，故扩增产物可能会在电泳等检测过程中污染移液器、操作台，或者产物随着被蒸发可能会形成气溶胶引起污染，进而导致假阳性。排除该因素的方法对PCR扩增仪彻底消毒，且彻底更换离心管、移液器后重新检测。观察是否为上机扩增污染而引起假阳性。

总言而之，实时荧光定量法检测2019-nCoV核酸的敏感性较高，造成其假阳性结果的因素相对较为单一，主要是核酸污染、PCR仪器的性能差异和温控不准等质量问题造成非特异性扩增以及结果判断失误三大因素，因此，需要进一步完善PCR实验室质量控制，提高检验工作人员的规范操作，准确判断结果，以降低核酸检测假阳性率，为疫情防控提供更为可靠的诊断结果。

参考文献

[1]武汉大学中南医院新型冠状病毒感染的肺炎防治课题组,靳英辉,蔡林,等.新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的肺炎诊疗快速建议指南(完整版)[J].医学新知,2020,30(1):35-64.

[2]王晟,刘兴态,秦军,等.738例新型冠状病毒肺炎病例密切接触者核酸筛查结果分析[J].中国感染控制杂志,2020,19(4):297-300.

[3]李俊英,葛文超,王艺芳,等.浅谈核酸检测关键环节的质量控制[J].中国卫生检验杂志,2020,30(11):1404-1406.

[4]周丹,何进才,黄涛,等.1844例新型冠状病毒核酸检测及生物安全防护实践[J].实验与检验医学,2020,38(2):212-214,230.

[5]王卓,刘宏波,金美松,等.多种类型检测试剂及不同样本处理方式对新型冠状病毒核酸检测结果的影响[J].解放军预防医学杂志,2020,38(8):103-105,110.