清脾除湿饮对特应性皮炎小鼠的TLR-4、NF-κBp65表达的影响

张洁琳

摘要：目的 分析、探究清脾除湿饮对特应性皮炎小鼠的TLR-4、NF-κBp65表达的影响。方法 选取18只BALB/c小鼠，其中有12只小鼠被制成AD模型小鼠，根据随机数表法将18只小鼠分为三组，即中药组、模型组及空白组。对比3组TLR-4、NF-κBp65蛋白表达的变化情况。结果 经LSD检验，3组TLR-4具有明显的统计学差异（P＜0.05），其中模型组表达水平最高，中药组第二，空白组表达水平最低：3组NF-κBp65具有明显的统计学差异（P＜0.05），其中其中模型组表达水平最高，中药组第二，空白组表达水平最低。结论 经医学分析，清脾除湿饮具有通过影响TLR-4的表达进而阻断NF-κBp65通路来释放出炎性因子的释放，有助于促进特应性皮炎的康复。

关键词：清脾除湿饮；特应性皮炎；小鼠；TLR-4；NF-κBp65；表达影响

特应性皮炎的英文全称为Atopic dermatitis，因此可简称为AD。医学研究发现，此病与患者群体的遗传具有一定的相关性，多数AD患者伴有过敏性鼻炎、慢性咳嗽、复发性皮肤病及炎症性皮肤病等病症，对AD患者的身体健康及生活质量都构成了严重影响。分析AD患者的发病因素，皮肤屏障功能受损以及病原微生物定植等都是主要诱发因素，病原微生物不但会诱发AD患者的病症，还会加重AD患者的症状，但是即便是医学研究相对更为发达的现代，也未能明确AD具体的发病机制[1-2]。本次研究中将以18只BALB/c小鼠为研究对象，旨在分析、探究清脾除湿饮对特应性皮炎小鼠的TLR-4、NF-κBp65表达的影响，现将研究结果整理如下。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

选用18只清洁级BALB/c小鼠，均为雄性，6周龄，体重区间为16~22g，购自北京维通利华动物技术有限公司，批号为：11401500010005。安置于SPF级动物房中，将室内温度控制在25℃上下，相对湿度控制在50%~60%之间，昼夜时间各为12个小时，让小鼠自由进食进饮。所有的实验都应该严格遵循国家动物实验的使用、伦理学等各项要求。

1.1.2 实验用试剂

使用试剂为：鼠抗人TLR-4单克隆抗体，选用自美国Abnova公司，鼠抗人NF-κBp65单克隆抗体，选用自美国Santa Cruz公司，同时应用DAB显色试剂盒、SP免疫组化盒，选用自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

根据随机数表法将18只小鼠分为三组，即中药组、模型组及空白组，每组各6只，其中将模型组与中药组的小鼠制作为AD模型，以DNCB外涂法进行造模处理。中药组给予清脾除湿饮灌胃处理，根据小鼠的体质量，10g给药0.1ml，同时给予模型组及空白组生理盐水灌胃，浓度为0.9%。一天灌胃一次，持续为三组灌胃3周。

1.3 免疫组化

TLR-4阳性表达定位于细胞膜和（或）细胞质，实验后呈现出黄色或棕黄色；NF-κB p65阳性表达定位于细胞质及细胞核，实验后呈现黄色或棕黄色颗粒，着色程度以阳性细胞所占的百分比来进行表现。

1.4 统计学方法

采用SPSS21.0分析，计量资料以（±s）表示，经t检验，计数资料经x2检验，以（%）表示，差异有统计学意义为P＜0.05。

2 结果

经LSD检验，3组TLR-4具有明显的统计学差异（P＜0.05），其中模型组表达水平最高，中药组第二，空白组表达水平最低：3组NF-κBp65具有明显的统计学差异（P＜0.05），其中其中模型组表达水平最高，中药组第二，空白组表达水平最低，详见表1。

表1 三组TLR-4、NF-κBp65表达情况（±s）

组别	例数	TLR-4	NF-κBp65
空白组	6	1552.23±133.25a	1564.21±149.54b
模型组	6	2354.84±180.43a	2403.94±223.46b
中药组	6	2054.16±166.27a	1934.57±197.49b

注：三组对比，aP＜0.05；三组对比，bP＜0.05.

3 讨论

以目前的医学研究情况来看，AD的发病机制仍旧不够明确，但是可以知道的是，角质的形成细胞不仅是构成皮肤重要屏障的关键细胞，同时也参与了皮肤的组织免疫反应。当人体皮肤受到了损伤或外源性刺激后，角质形成细胞将分泌出诸多的生物活性分子直接参与到皮肤组织天然的免疫反应中。对于人体而言，皮肤屏障及免疫功能异常将诱发诸多不适，对患者的身体健康构成了严重影响。如果皮肤屏障受到了破损或出现了缺陷，外界的抗原就能轻易透过皮肤组织，并在与抗原体进行相互作用的过程中诱发出级联免疫反应，而免疫反应又会反过来加剧皮肤屏障功能的失衡，导致患者面临更为严重的病情[3-4]。

TLR-4是一种分布较为广泛的重要模式识别受体，研究发现TLR-4的作用在于可以调控诸多免疫、炎症性疾病发病过程中的信号转导，对疾病的发生及加剧都具有较为重要的影响；NF-κBp65则是一种哺乳类动物细胞中特有的转录调控因子，它的特点是可以直接跟细胞免疫相关的基因启动因子的κB序列进行结合，并发挥出相应的核转录因子作用，比如本次研究中的p65亚基就是发挥转录激活功能的关键性成分

[5-6]。

经由AD小鼠模型实验后发现，TLR-4、NF-κBp65在本研究中都存在显著的高表达现象，且二者之间还具备一定的正相关性，这一特点说明TLR-4与NF-κBp65之间确实存在某种通路上的相关性。经中药清脾除湿饮的干预，发现TLR-4的表达出现一定程度的下降，出现这一结果的原因可能是因为清脾除湿饮对TLR-4、NF-κBp65的信号转导通路具有相应的影响，而这种影响最终使得原本已经失衡的免疫状态逐渐回到平衡状态，具有将为理想的治疗作用。

综上所述，经医学分析，清脾除湿饮具有通过影响TLR-4的表达进而阻断NF-κBp65通路来释放出炎性因子的释放，有助于促进特应性皮炎的康复。

参考文献：

[1]王雄, 姚春海, 刘青云等. 龙牡汤对特应性皮炎小鼠模型的TLR-4、NF-κB p65表达影响[J]. 中国中西医结合皮肤性病学杂志, 2019, 18(3):4.

[2]张春华, 马欣, 丁佩军等. 白鲜碱对特应性皮炎小鼠PKCα/NF-κB通路及肥大细胞浸润的影响[J]. 热带医学杂志, 2021, 21(6):8.

[3]赵展庆, 张万科, 符妹垂等. 屈头鸡果对哮喘小鼠气道炎症细胞及肺组织NF-κBp65、TGF-β1的调节作用研究[J]. 临床和实验医学杂志, 2019, 018(001):6-9.

[4]肖南, 唐松江, 李曦等. 丙泊酚抑制NF-κB p65的磷酸化缓解葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠病理损伤和免疫反应[J]. 现代免疫学, 2021, 41(5):6.

[5]张晓芹. 柴芩承气汤通过抑制TLR4/NF-κB p65通路减轻小鼠重症急性胰腺炎并发肝损伤[J]. 中国药理学通报, 2020, 36(1):6.

[6]巩子汉, 段永强, 成映霞等. 白芨多糖对胃溃疡模型大鼠胃组织IL-17,IL-23,TLR-4及NF-κB p65基因和蛋白表达水平影响的研究[J]. 中国免疫学杂志, 2020, 36(7):6.

黑龙江省中医药科研项目

项目名称：基于肠道菌群研究清脾除湿饮对特应性皮炎模型小鼠的作用机制

编号ZHY2020-073

课题人 张洁琳