苹果树腐烂疾病病原种类及其亲缘关系分析

刘曰兰 ,刘文明

【摘要】目的：探究导致苹果树腐烂的病原种类并且分析其亲缘关系。方法：使用常规组织分离法与枝条烫伤接种法对样本材料进行菌株的分离与鉴定，并且对于菌落的形态和发病情况进行相应记录。利用生物手段获取β—tubulin和EF—12序列，进行扩增后通过NCBI与Blast进行同源性分析。发育树经邻接法构建后进行同源性分析。结果：菌落的最适生长温度，pH值，碳源和氮源分别为20~30℃、5~6、葡萄糖和蛋白胨。分离菌株数量为11，经接种后均导致健康枝条发病，并且可进行同数量菌株分离。与菌株亲缘关系较近的是Valsa mali , Valsa ceratosperma。结论：实验地区的主要致病病原为V.mail，其次为V.ceratosperma,并且在PDA中出现的培养性状存在差异。

【关键词】苹果树；腐烂疾病；病原种类；亲缘关系

苹果树出现腐烂病的现象的比例不断上升，但是目前关于苹果树腐烂病的致病菌株尚未得到明确答案，而已有的实验研究多注重提高苹果品质，对于治病机理的研究较为匮乏[1-2]。腐烂病会导致产量较低，甚至导致树体死亡，因此明确苹果树腐烂病的病原种类及其亲缘关系十分重要。

1.资料与方法

1.1一般资料

实验进行时间为2020年5月到2022年5月，地点为实验果园，样本采集内容为选取六枝带有健康组织的发病枝和树皮。按照标准比例配置马铃薯葡萄糖琼脂培养基。进行接种的枝条为不超过两年生的健康苹果枝条。实验进行需要的部分设备包括超低温冷冻箱、蒸汽灭菌锅、智能光照恒温培养箱、基因扩增仪、小型扩增仪等。

1.2方法

通过常规组织分离法获取组织块，要求为包含典型腐烂病的部分，经乙醇等消毒，无菌水冲洗，晾干后移至PDA，进行光暗交替培养，温度为25℃，时间为3天。最终处理获得纯化菌株，斜面试管4℃保存。培养观察阶段在不改变温度的情况下将纯化菌株平板进行暗培养，第二天进行相应培养指标的观察，生长速度的测量方法采取十字交叉法。测定致病性时将健康枝条取段、冲洗、乙醇浸泡、无菌水冲洗，利用灼热打孔器等距烫伤。培养3天的菌落取相应菌饼，按照具体标准与枝条结合，并与无菌PDA同时进行25℃光暗恒温培养，形成对照，并每五天进行一次记录。菌株DNA提取要进行所需药品和试剂的配制。打孔器提取菌丝（培养三天后的），在0.1L中PD溶液中摇床震荡培养五天，后经无菌纱布四层过滤、冲洗、烘干后-80℃离心管超低温保存。参考改良的CTAB法对腐烂病的菌株的总DNA进行提取，并与-20℃温度保存[3-4]。进行PCR技术扩增的基因片段为β—tubulin和EF—12，所用的引物分别为（Bt2a和Bt2b）（EF-1728F和EF-986R）。具体环节：预变性、变性、退火、延申，前者基因片段所用时间温度为（3min,30s,30s,1min）（94℃,94℃,61℃,72℃）,循环38次再延申10min, 后者基因片段所用时间温度为（4min,30s,45s,30s）（94℃,94℃,55℃,72℃）, 循环40次再72℃延申10min，所得产物进行专业测序[5]。

1.3观察指标

菌落颜色、边缘、直径、平均生长速度、产孢情况、菌丝气生性，菌株基因片段的亲缘关系，并对致病性进行比较，对病原进行鉴定。

1.4统计学分析

进行序列同源性对比的网站为GenBank,系统发育树建立方法为邻接法，借助软件版本为MEGA7.0。

2.结果

经3天培养处理后的菌落中淡黄色7个，乳白色4个。15天培养的菌株多为黄褐色，以20mm/d速度生长。接种3天出现明显病斑，15天蔓延整根，且只有乳白色菌株产生黑点，经证明无黑点的菌株为优势株。经鉴定为V.mail的占据60%，其中两种颜色均存在，V.ceratosperma的占据40%，均为淡黄色。β—tubulin序列中4个菌株与V.ceratosperma亲缘较近，4个与V.mail较近。EF—12序列中9个与V.mail亲缘关系较近。

表1 两类菌株培养性状

菌株类别	菌落颜色（3天）	菌落颜色（15天）	菌落边缘	菌丝气生性	菌落直径（2天）（mm）	平均生长速度（mm/d）	菌落产孢情况
淡黄色菌株	淡黄色	黄色、黄褐色	放射状	无	55.12±1.26	26.69±1.32	6株产孢第7-8天
乳白色菌株	乳白色	黄褐色	羽毛状	无	44.98±2.81	23.16±1.75	2株产孢第7-8天

3.讨论

壳囊孢的种类与范围较多，并且相似度较高，依靠传统的常规方式很难对其进行判断[6]。因此本文增加了基因序列扩增对照的方式，增加了实验的可靠性，并且为了降低偶然性的发生，扩增对比了两组基因片段，最终的实验结果与以往的资料结论相符合[7]。本次实验通过对病原菌进行分离、培养、纯化，对菌株的性状进行对比观察，测定其致病性，并且提取DNA进行体外扩增并与基因库中的已有基因进行对比,最终确定苹果树并病原种类与其亲缘关系。本次实验所采集的苹果树腐烂病菌为V.mail和V.ceratosperma，其结果对于苹果树的腐烂病防治具有重要意义，但仍旧需要进一步的扩大实验样本得到更加准确的答案。

参考文献

[1] 李亚鹏,张王斌,仪子博. 苹果树腐烂病病原种类及其亲缘关系分析[J]. 新疆农业科学,2022,59(3):700-706.

[2] 林晓,孙传茹,王彩霞,等. 影响苹果树腐烂病菌侵染致病的流行因子[J]. 中国农业科学,2021,54(11):2333-2342.

[3] 刘广庆. 内蒙古化德县苹果树腐烂病的发生与绿色防控[J]. 农业工程技术,2022,42(1):42,44.

[4] 杜江理. 苹果树腐烂病发病机理及预防机制探究[J]. 种子科技,2021(14):83-84.

[5] 李秀林.苹果树腐烂病发病机理及预防机制探究 [J].种子科技,2019,37(14):110-111.

[6] 李文娟. 内蒙古赤峰南山生态果园寒富苹果树腐烂病绿色防治[J]. 农业工程技术,2022,42(5):37,39.

[7] 袁丽红. 苹果树腐烂病发病原因及防治对策[J]. 甘肃林业,2022(1):43-44.