缺氧条件下新片罗素A对内皮细胞增殖、迁移的影响

赵凯欣1,李宁1,杨丽1,2

摘要：目的 探讨缺氧条件下, 新片罗素A对内皮细胞的影响。方法 CCK-8筛选CoCl2适宜浓度，构建缺氧细胞模型。通过细胞增殖试验、细胞划痕试验利用IncuCyte ZOOM动态观察缺氧条件下不同浓度新片罗素A对EA.hy926细胞增殖、迁移的影响。实验结果采用单因素方差分析。结果 细胞活性在100mol/L CoCl2干预24h与正常组相比具有非常显著性差异（p<0.01）。缺氧条件下，新片罗素A可呈浓度依赖地抑制细胞增殖、迁移。结论 缺氧条件下，新片罗素A可以抑制内皮增殖、迁移。

关键词：化学缺氧；内皮细胞；增殖；迁移

Abstract: OBJECTIVE To investigate the effect of neolamellarin A on endothelial cells under hypoxia. METHODS CCK-8 was used to determine the optimal concentration range for CoCl2 and to construct a hypoxic cell model. The effect of different concentrations of neolamellarin A on the proliferation and migration of EA.hy926 cells under hypoxia was dynamically observed by cell proliferation experiment and cell scratch experiment. The experimental results were analyzed by one-way ANOVA. RESULTS There was a significant difference in cell activity between the 100mol/L CoCl2 intervention group and the normal group (p<0.01). Under hypoxia, neolamellarin A can inhibit cell proliferation and migration in a concentration dependent manner. CONCLUSION Neolamellarin A can inhibit endothelial proliferation and migration under hypoxia.

Key words: Chemical hypoxia; Endothelial cells; Proliferation; migration

内皮细胞（Endothelial Cell, EC）是构成动脉、静脉和毛细血管的重要组成部分，若受到损伤，会受到多种因子的调控，通过调节全身营养物质和氧气的供应，支持组织生长和修复[1]。正常条件下EC处于静态，在缺氧条件下，EC受到缺氧反应途径调控快速分裂，从已有的血管生出新的血管[2]，这些情况大多发生在心血管并发症[3]、视网膜病[4]和癌症[5]等病理状况。

缺氧的生理反应在很大程度上受缺氧诱导因子（Hypoxia-inducible Factor, HIF-1）的调节[6]，近年来，大量的实验和临床数据证实了HIF-1是血管新生疾病的治疗靶点，HIF-1活性可能会影响多内皮功能障碍相关疾病的进展和严重程度[7]。

最近报道的许多药物都表现出良好的抑制HIF-1的活性[8]，新片罗素A是2007年从海绵中提取而来[9]，在人乳腺癌细胞系T47D的细胞报告基因测试中，表现出HIF-1抑制活性。2019年由大连理工大学李广哲课题组成功合成了新片罗素A[10]，并在Hela细胞中构建了双萤光素酶报告基因模型，研究发现新片罗素A表现出显著的HIF-1抑制活性，但在缺氧条件下对EC的影响尚不明确。本文采用人血管内皮细胞株EA.hy926细胞作为研究对象，探究缺氧条件下新片罗素A对EA.hy926増殖、迁移的影响，以期为相关研究提供参考。

1 材料

1.1 细胞系

人脐静脉融合细胞EA.hy926细胞，购于中国科学院上海细胞库。

1.2 试剂

新片罗素A，由大连理工大学李广哲老师研发合成馈赠；YC-1 （公司：Selleck，批号：S7958）；氯化钴（公司：Gibco，批号：C11995500BT）；DMEM高糖培养基（公司：SERANA，批号：S-FBS-SA-015）；胎牛血清（公司：Biosharp，批号：BL201A）；CCK-8试剂盒（公司：Beyotime，批号：C0040）。

1.3 仪器

细胞培养箱（公司：美国Thermo，批号：3111）；超净台（公司：美国Thermo，批号：1287）；细胞划痕器（公司：美国ESSEN）；倒置生物显微镜（公司：日本OLYMPUS，批号：CK40）；MultiskanTM FC酶标仪（公司：Thermo scientific）；IncuCyte ZOOM（公司：美国Essen Bioscience：）。

2 方法

2.1 细胞培养

细胞培养于含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的DMEM高糖培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中，取对数生长期细胞进行实验。

2.2 CCK-8试验

将对数生长期的EA.hy926细胞以5x103密度接种于96孔板中，于37°C、5%CO2的培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃去培养液，向各孔分别加入终浓度为0、50、100、200、400、800mol/L的CoCl2溶液200L，分别培养12h、24h和48h（期间换液一次），吸出孔中液体，每孔加入无血清培养基100L和CCK-8溶液10μL，继续培养1h后置酶标仪上，测各孔在450nm的吸光度值（OD值）。每组设置4个复孔，实验重复三次。

2.3 细胞分组

正常组(EA.hy926)；模型组（EA.hy926+100μmol/LCoCl2）；低剂量组（EA.hy926+100μmol/LCoCl2+2μmol/L新片罗素A）；中剂量组（EA.hy926+100μmol/LCoCl2+10μmol/L新片罗素A）；高剂量组（EA.hy926+100μmol/LCoCl2+50μmol/L新片罗素A）；阳性对照组（EA.hy926+100μmol/LCoCl2+10μmol/LYC-1）；

2.4 细胞增殖

将对数生长期的EA.hy926细胞以3x103密度接种于96孔板中，于37°C、5%CO2的培养箱中培养12h，弃去培养液，按2.3下的分组进行给药（完全培养基配制），各孔加入不同组别培养液200μL，隔日换液一次。放置于细胞培养箱内的IncuCyte ZOOM变焦活细胞成像系统内，设置好程序，10x的镜头下每2h拍摄一个视野，进行动态观察细胞的生长状况，拍摄120h。通过内置软件分析每张图片，观察细胞增殖情况。每组5个复孔，实验重复3次。

2.5 细胞划痕

将对数生长期的EA.hy926细胞以1x104密度接种于96孔板中，于37°C、5%CO2的培养箱中培养约24h，使其形成完全融合的连续单层细胞，置入已消毒的ESSEN细胞划痕器操作形成细胞层划伤。按2.3下的分组进行给药（无血清培养基配制，含有1%的青链霉素混合溶液），各孔加入不同组别培养液200μL。放置IncuCyte ZOOM中按说明书设置好程序开始培养24h并拍摄。通过内置软件进行数据分析。每组6个复孔，实验重复3次。

2.6 统计学分析

三次实验重复得到的数据，应用Graphpad Prism 7.0统计分析软件对数据进行分析，并以±S表示。单因素方差分析，p<0.05表示差异具有显著性差异，p<0.01表示差异具有非常显著性差异。

3结果

3.1 不同浓度CoCl2对EA.hy926细胞活性影响

CCK-8结果显示（见表1），与正常组相比，12h和24h时，随着CoCl2浓度的升高，细胞活性出现先增长后抑制的趋势，于100mol/L细胞活性最高，具有非常显著性差异（p<0.01）。48h时随着CoCl2浓度的升高，细胞活性逐渐降低，存在显著性差异（p<0.05或p<0.01）。因此选择100mol/L CoCl2干预24h作为造模条件，进行后续实验研究。

表1 不同终浓度CoCl2对EA.hy926细胞增殖的影响（n=4）

组别	药物浓度（μmol/L）	细胞活性
		12h	24h	48h
正常组	0	1.00±0.11	1.00±0.02	1.00±0.03
模型组	50	1.19±0.07	1.2±0.02**	0.85±0.08*
	100	1.34±0.11**	1.28±0.03**	0.73±0.12**
	200	1.33±0.10**	1.06±0.03	0.61±0.02**
	400	1.04±0.05	0.66±0.05**	0.31±0.03**
	800	0.90±0.02	0.12±0.01**	0.08±0.01**

注：*：与正常组相比具有显著性差异（p<0.05）；**：正常组相比非常具有显著性差异（p<0.01）；

3.2 新片罗素A对缺氧EA.hy926细胞增殖能力的影响

细胞增殖试验结果显示（见表2，图1），24h和48h不同组别细胞增殖率没有明显差异（p＞0.05）。72h和96h与正常组相比，模型组的细胞增殖率非常显著增加（p<0.01）；与模型组相比，新片罗素A低、中、高剂量组干预后细胞增殖率非常显著下降（p<0.01）；YC-1干预后细胞增殖率非常明显下降（

p<0.01）。

表2 IncuCyte ZOOM动态监测不同浓度新片罗素A对缺氧EA.hy926细胞增殖能力的影响（±S，n=5）

时间/h	正常组	模型组	低剂量组	中剂量组	高剂量组	阳性对照组
24	7.50±1.93	8.30±1.95	8.02±0.74	9.04±1.81	9.2±3.95	8.87±0.59
48	16.18±2.46	19.22±4.78	15.62±1.15	19.79±4.10	17.17±4.51	17.72±1.06
72	25.35±3.34	45.49±9.54**	27.39±2.48##	29.66±6.66##	28.38±4.75##	27.27±2.14##
96	35.13±3.67	80.16±10.80**	45.31±3.72##	42.78±10.62##	34.02±3.97##	43.16±4.10##

注：**：与正常组相比有显著差异（p<0.01）；##：与模型组相比有显著差异（p<0.01）。

图1新片罗素A不同浓度影响缺氧内皮细胞增殖能力趋势图

3.3 新片罗素A对缺氧EA.hy926细胞迁移能力的影响

细胞划痕试验结果如图2、图3所示，与正常组相比，模型组的相对伤口密度非常显著增加（p<0.01）。与模型组相比，新片罗素A低剂量干预后相对伤口密度有所下降，无统计学意义；中剂量组相对伤口密度显著下降（p<0.05）；高剂量组相对伤口密度非常显著下降（p<0.01）。阳性对照药YC-1干预后细胞相对伤口密度呈下降趋势，无统计学意义。

图2 不同浓度新片罗素A处理24h时对缺氧内皮细胞迁移的影响比较

注：A. 正常组；B. 模型组；C. 新片罗素A低剂量组2mol/L；D. 新片罗素A中剂量组10mol/L；E. 新片罗素A高剂量组50mol/L；F. 阳性对照组

图3 不同浓度新片罗素A对缺氧内皮细胞迁移能力影响柱状图

注：**：与正常组相比，具有统计学差异（p<0.01）；#：与模型组相比具有显著性差异（p<0.05）；##：与模型组相比非常具有显著性差异（p<0.01）。

4讨论

EC是血液与组织间的首道屏障，是发生缺氧时最先受到影响的细胞之一。缺氧情况下EC发生损伤与凋亡，并分泌大量相关因子造成血管内皮损伤，从而引发血管功能障碍。HIF-1在缺氧反应途径中起着关键的作用，而新片罗素A在前期研究中表现出明显的HIF-1抑制活性，本文探究缺氧条件下新片罗素A对EA.hy926增殖、迁移影响，结果显示其细胞增殖能力及迁移能力明显减弱，表明新片罗素A可抑制缺氧EA.hy926细胞增殖、迁移，并且这种抑制作用呈浓度依赖性。

综上所述，本文首次证实新片罗素A可以抑制缺氧EA.hy926细胞增殖和迁移能力，这为新片罗素A抗血管生成从而治疗血管生成类疾病提供治疗思路，但其具体作用机制尚不明确，还需进一步深入探索研究。

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基金项目：中央高校基本科研业务费资助（DUT21YG134）；沈阳市科技创新专项资金项目（F15-170-4-00）。

通讯作者：杨丽，E-mail：[e-mail]