高效液相色谱法测定尿塞通片中丹参素的含量

张瑞昆

摘  要：目的：建立一种用高效液相色谱法测定尿塞通片中丹参素含量的测方法。方法：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱（Hanbon Science；5um；4.6×250mm）；以甲醇-1%醋酸水溶液（6：94）为流动相；检测波长为280nm；柱温40℃。流速为1.0ml/min。  结果：丹参素钠在3.288～32.88μg/ml范围内线性关系良好，回归方程∶y =6273.2x-790.89，相关系数∶r=1。平均回收率=98.09%，RSD=1.30%，表明该法回收率良好。结论：用高效液相色谱法测定尿塞通片中丹参素的含量，方法简便，结果准确，重现性好。

关键词：高效液相色谱法；丹参素；尿塞通片；含量测定

1．仪器与试药

1.1仪器

岛津LC-2010A高效液相色谱仪，Easy3000色谱工作站，UV-1700型紫外可见分光光度计（岛津公司）；SARTORIUS CP225D电子分析天平，KQ-250DB 超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2试药

丹参素钠（中国药品生物制品检定所，批号110855-200809（供含量测定用））甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2.结果与分析

2.1色谱条件

2.1.1流动相

甲醇-1%醋酸（6∶94），流速∶1.0ml/min，柱温：40℃，进样量∶对照品溶液10μl；供试品溶液5μl。

2.1.2固定相

Agilent TC-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），检测波长∶280nm。

2.1.3检测波长的选择

配制适宜浓度的丹参素钠对照品溶液，在200~400nm之间做紫外扫描，结果在280nm处有最大吸收，故选择280nm为本品含量测定检测波长。见图1。

图1  丹参素钠UV色谱图

2.1.4分离条件选择

以甲醇-1%醋酸为流动相，按（8：92）、（7：93）、（6：94），柱温按25℃、35℃、40℃进行试验，结果以甲醇-1%醋酸（6：94）为流动相，柱温40℃时，丹参素钠与其它杂质峰完全分离，且峰形对称，保留时间适中，理论塔板数较高。故选择甲醇-1%醋酸（6：94）为本品含量测定流动相，柱温为40℃。

2.2系统适用性试验

按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行分离测定，结果丹参素钠分离度高，理论塔板数按丹参素钠峰计，不低于4000。

2.3试验溶液的制备

2.3.1供试品溶液制备方法的确定

2.3.1.1 提取方法的选择

取本品，对超声波提取、60℃水浴提取2种提取方法制得供试品溶液中丹参素的含量进行比较，具体方法为：

超声波提取：取本品20片，除去包衣，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入0.1mol/l的盐酸溶液20ml，超声处理（功率250W，频率40KHz）20分钟，放冷，加氯化钠1g使溶解，用乙酸乙酯振摇提取5次，每次30ml，合并乙酸乙酯液，置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

60℃水浴提取：取本品20片，除去包衣研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入0.1mol/l的盐酸溶液20ml，60℃水浴提取20分钟，放冷，加氯化钠1g使溶解，用乙酸乙酯振摇提取5次，每次30ml，合并乙酸乙酯液，置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

照样品测定方法分别测定上述两种提取液中丹参素的含量，超声波提取的含量为0.9049mg/g，60摄氏度水浴提取的含量为0.9040mg/g,表明两种提取方法基本一致，由于超声波提取法方便快捷，故正文选择超声波提取法。

2.3.1.2 水解液加入量的选择

根据文献报道，丹酚酸A、B、C及迷迭香酸等丹参素综合物易发生酯键水解反应而生成丹参素，为了更完全的测定制剂中丹参素含量，采取酸水解的方式使制剂中丹参素得以完全提取出来，故选择0.1mol/l盐酸为提取液，并对其加入量进行选择。按确定的超声波提取方法，0.1mol/l盐酸加入量为10ml、20ml、30ml，分别制成供试品溶液，依法测定丹参素的含量，结果 10ml为0.8910mg/g，            20ml为0.9056mg/g，30ml为0.9056mg/g，表明水解液加入量对丹参素含量影响不大，故选择水解液加入量为20ml。

2.3.1.3 提取时间的选择

按以上选定的条件，选择超声10分钟、20分钟（同4.2项下水解液加入量20ml份样品）、30分钟分别提取，制成供试品溶液，依法测定丹参素的含量，结果表明超声10分钟丹参素含量为0.8382，超声20分钟和超声30分钟分别为0.9056mg/g、0.9031mg/g，故选择超声时间为20分钟。

2.3.1.4 萃取次数的选择

按以上确定的条件，选择乙酸乙酯萃取4次、5次（同4.2项下水解液加入量20ml份样品）、6次分别提取，制成供试品溶液，依法测定丹参素的含量，结果表明萃取次数为4次丹参素含量为0.8476mg/g，萃取6次供试品中丹参素含量与之前萃取5次的含量分别为0.9056mg/g、0.9048mg/g，故选择乙酸乙酯萃取次数为5次。

按以上确定的条件，乙酸乙酯加入量按20ml、30ml、40ml分别提取，制成供试品溶液，依法测定丹参素的含量，结果见表5，表明乙酸乙酯加入量20ml时丹参素含量为0.8459mg/g，乙酸乙酯加入量30ml和40ml时丹参素含量分别为0.9066mg/g、0.9033mg/g，故选择乙酸乙酯加入量30ml。

2.3.1.6供试品溶液制备小结

取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入0.1mol/l的盐酸溶液20ml，超声处理（功率250W，频率40KHz）20分钟，放冷，加氯化钠1g使溶解，用乙酸乙酯振摇提取5次，每次30ml，合并乙酸乙酯液，置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 对照品溶液的制备

取丹参素钠对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含10μg的溶液，即得（每1ml含丹参素9μg）。

2.4 线性关系的考察 

精密称取丹参素钠对照品5.48mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释成0.1096mg/ml的对照品溶液，精密量取7.5ml置25ml量瓶中 ，加流动相稀释至刻度，作为母液，精密量取母液：1ml、2ml、4 ml、6 ml、8ml、10ml（直接用母液），分置10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得浓度为3.288μg/ml、6.576μg/ml、13.152μg/ml、19.728μg/ml、26.304μg/ml、32.087μg/ml的对照品溶液，分别从中精密吸取10μl，依次注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，丹参素钠的浓度（μg/ml）为横坐标，绘制标准曲线。

回归方程∶y =6273.2x-790.89，相关系数∶r=1。结果表明∶丹参素钠在3.288～32.88μg/ml范围内线性关系良好。

另作精密度、稳定性、回收率实验，结果均良好。

2.5样品含量测定

取本品三批样品，按正文供试品溶液制备方法制备并测定，结果丹参素平均含量分别为0.318%、0.321%、0.337%。

2.6丹参药材中丹参素含量测定

按照含量测定项下方法，依法操作，结果平均丹参素平均含量为0.223%

根据以上结果确定丹参药材中含丹参素不得少于0.16%

3.讨论

经试验采用不同的色谱柱及不同的色谱仪对试验结果没有影响，改变色谱条件对实验结果影响不大，只是保留时间有改变，表明方法耐用性好。

用高效液相色谱法测定尿塞通片中丹参素的含量，方法简便，结果准确，重现性好，能很好的对尿塞通片中丹参素含量进行测定，以达到控制尿塞通片质量的目的。

参考文献

[1]  中华人民共和国卫生部药典委员会编，中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第八册：WS3－B－1555－93. [3]

[2]  中国医院药学杂志2005年第25卷第9期Chin Hosp Pharm J，2005 Sep，Vol 25，No．9李桃，王春娥.高效液相色谱法测定丹参药材中丹参素的含量

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